Dynamin类似蛋白在产油菌RHA1中参与脂滴形成过程的研究

As one of the important cellular organelles, the mechnism of lipid droplets (LDs) formation remains unknown which will not only having benifet to understanding the human metabolic diseases but also the development of bioenergy.In this study, Prokaryotic oleaginous Rhodococcus sp.RHA1 was selected to study the LD formation and dynamic changes for the reason of they are simple and have the LDs as the only existed organelles in its body.There are four dynamin-like genes in this bacteria which may take the role of pinch the LDs form the plasma membrane. The LDs will be isolated and the proteomics will be analysis to further studying the Dynamin-like proteins with the combanition of biochemistry and bioinformatics. The target gene will be deleted using homologous recombination or be overexpressed to further analyze the function of these genes. During this process, the confocol and electronic microscopy, TAG analyzing as well as the immunoprecipitation will used to view the phenotype to further understanding the mechnism of LD formation with the help of Dynamin like proteins.

脂滴是细胞内重要的细胞器之一，它的形成机制研究不但对于更深刻地探索人类代谢疾病具有重要作用，而且为生物能源的开发和利用提供理论依据和应用支持。选择只含有脂滴的原核生物来进行脂滴形成和动态变化的研究有助于该项工作的顺利进行。产油菌Rhodococcus sp. RHA1中含有Dynamin类似蛋白，我们认为这类蛋白在脂滴形成的过程中起到重要作用，即参与脂滴从质膜上的脱落过程。本研究拟利用生物化学与生物信息学结合的方法，分离并纯化脂滴，进行蛋白质组学分析，从而进一步地寻找与确定Dynamin类似蛋白与相关基因；并使用同源重组基因敲除以及蛋白表达等分子生物学方法，来研究这些蛋白的分布与功能，分析该类蛋白的表达和定位对脂滴的形成、大小变化的影响；同时使用激光共聚焦显微镜、电镜、甘油三酯定量测定和免疫共沉淀等形态学与生物化学方法来研究Dynamin类似蛋白介导脂滴形成的分子机制。

作为细胞内一种重要的细胞器——脂滴，是细胞内脂质代谢的核心部分和重要场所，与人类多种代谢疾病密切相关，例如肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化和心血管疾病等。但目前对于脂滴的形成和动态变化的分子机理却知之甚少。本课题选择胞体内仅有脂滴这一种细胞器的原核生物作为研究模型，屏蔽了真核生物内多种细胞器相互干扰的影响，对脂滴的形成和动态变化进行研究。首先，利用脂滴蛋白质组学和生物信息学相结合的方法，检测出产油菌中的5个Dynamin样蛋白，利用同源重组的方法，对这些目标蛋白进行单个或组合型的基因敲除，Dynamin样蛋白基因突变株的中性脂主要分布于菌体的质膜上，表明这些目标蛋白可能参与脂滴的形成过程。进一步定量测定发现，目标基因的缺失对菌体内总脂含量未产生明显区别。同时定位目标蛋白在菌体内的定位，发现其主要分布在菌体的质膜上。其次，将目标蛋白导入不含有脂滴的蓝细菌中观测其对脂滴形成的影响。结合前期的实验数据，推测Dynamin样蛋白需要与其它脂滴蛋白相互作用，共同促进脂滴的形成。在此过程中，同时深入研究了产油菌中脂滴大小调控蛋白MLDS（microorganism lipid droplet small）的相关功能。发现mlds上游基因编码的转录调控因子MLDSR（MLDS regulator）可以正向和负向调节 MLDS 表达。并发现脂滴在产油菌中的新功能，脂滴可通过脂滴蛋白MLDS结合并保护基因组DNA, 从而增加了产油菌在紫外线照射和极端低氮环境下的存活率。本课题对脂滴形成和动态变化的研究，不仅为代谢疾病的机理研究提供理论基础，同时有助于对产油微生物的基因改造，为促进生物能源研究的发展提供理论依据与新思路。