红球菌3-硝基甲苯双加氧酶及其催化机理研究

Nitroaromatic compounds are a group of important emerging environmental pollutants. Therefore, the study of microbial metabolism of nitroaromatic compounds can help to eliminate the pollution and deepen the understanding of microbial metabolic pathway. Rhodococcus sp. strain ZWL3NT is a gram positive strain which can use 3-nitrotoluene as the sole carbon, nitrogen and energy source for growth. Although the metabolic pathway of 3-nitrotoluene has been predicted to be started by dioxygenase reaction in this strain, its dioxygenase encoding genes have not been reported. Dioxygenase reaction activating the benzene ring is always the rate-limiting step of nitroarene metabolic pathway. This project intends to study the 3-nitrotoluene dioxygenase at the molecular and biochemical level of the strain. The relationship between amino acid residues and different reaction products will be studied, referring to the reported protein structures of nitrobenzene dioxygenase. This would be the first nitroarene dioxygenase genes in the Gram positive bacteria. And with this study, the diversity of the key enzyme in nitroarene metabolic pathway in bacteria would be discussed.

硝基芳烃是一类重要的新兴环境污染物，研究硝基芳烃的微生物代谢，不仅可以帮助人们更好的消除硝基芳烃的污染，也能加深人们对微生物代谢途径多样性的理解。Rhodococcus sp. strain ZWL3NT是一株能以3-硝基甲苯为唯一碳源、氮源和能源生长的革兰氏阳性菌，尽管已有研究已经推测该菌中3-硝基甲苯的代谢途径起始于双加氧反应，该反应通常是代谢途径中的限速步骤，起到活化苯环的重要作用，但在该菌株中，参与起始反应的双加氧酶及其编码基因尚未报道。本研究拟从分子和生化水平研究该菌株中的3-硝基甲苯双加氧酶及其催化的代谢反应，并结合已报道的硝基苯双加氧酶的结构，研究活性中心关键氨基酸与不同酶反应产物的关系。这将是首次在革兰氏阳性菌中从分子水平阐述硝基芳烃双加氧酶，从而探索微生物降解硝基芳烃类物质的代谢途径及关键酶的多样性。

硝基芳烃的代谢途径在革兰氏阴性细菌中得到了广泛研究，已报道的代谢途径第一步都是通过nag家族的双加氧酶(是指类似于Ralstonia sp. strain U2菌株中萘双加氧酶NagAaAbAcAd的双加氧酶，如萘、硝基苯、2-硝基甲苯、2,4-二硝基甲苯等的双加氧酶)家族的酶催化的双加氧反应。双加氧反应通常是硝基芳烃的氧化降解的起始反应。而在革兰氏阳性菌中，此类双加氧酶从未报道。Rhodococcus sp. strain ZWL3NT是一株能以3-硝基甲苯为唯一碳源、氮源和能源生长的红球菌，本研究从分子水平研究该菌株中的3-硝基甲苯双加氧酶，进行了功能鉴定，并进行了进化分析。首次发现了一个联苯双加氧酶家族的硝基芳烃双加氧酶。 .本研究还发现2-氯硝基苯（2CNB）降解菌株Pseudomonas stutzeri ZWLR2-1能利用2-溴硝基苯（2BNB）为唯一碳、氮源和能源生长，并对其代谢途径中的两个关键酶进行了研究：采用生物转化法验证了2BNB代谢过程中的第一个关键酶，硝基芳烃双加氧酶CnbAaAbAcAd能催化2BNB生成3-溴邻苯二酚，并释放出亚硝酸根；通过克隆、表达、纯化以及酶活测定证明了邻苯二酚1,2-双加氧酶是2BNB降解过程中的第二个关键酶， 该酶由cnbC基因编码，可以将3-溴邻苯二酚转变为2-溴粘糠酸，并同时对3-溴邻苯二酚、3-氯邻苯二酚、邻苯二酚以及3-甲基邻苯二酚都有较高的活性，表明其具有广泛的底物适应性。.在研究2BNB降解过程中得到了中间代谢产物2-溴粘糠酸。粘糠酸是一种重要的化工中间原料，而卤族元素的加入会影响其理化性质，因此卤代粘糠酸具有潜在的工业应用前景，然而2-溴粘糠酸目前尚无利用生物法生产的报道。本研究利用邻苯二酚1,2-双加氧酶催化3-溴邻苯二酚生成2-溴粘糠酸，采用HPLC从酶促反应液中分离纯化2-溴粘糠酸，并通过LC-MS与核磁共振验证了其正确性。