蛋白磷酸酶2A类家族在小鼠卵子发生和成熟中的作用及机制研究

Both protein phosphorylation and dephosphorylation play important roles in living cell activities. Our previous studies revealed the regulation of key events in oogenesis, oocyte meiotic maturation and early embryo development by several protein kinases. Recently, we showed that both specific deletion of PP2A structural subunit Aα and overexpression of PP2A inhibitor SETβ caused premature chromatid segregation during mouse oocyte meiosis, and thus reduced female fertility. In the present study, by using oocyte-specific knockout technology, combining proteomics analysis, biochemical techniques, and live cell imaging, we will investigate the regulation of follicle development, oocyte maturation and early embryonic development by protein phosphatase 2A-like family members including PP2A, PP4 and PP6. Especially we will clarify the roles of these protein phosphatases in primordial follicle pool maintenance/activation, meiosis arrest/resumption, chromosome separation, and development of fertilized eggs. The upstream regulation and downstream substrates of PP2A subfamily, as well as related signal transduction pathways will also be studied. The findings will help deeply understand the molecular regulatory mechanisms oogenesis and oocyte meiotic maturation, and provide molecular bases for understanding, prevention and treatment of female infertility and birth defects.

蛋白质磷酸化和去磷酸化在细胞生命活动中发挥着至关重要的功能。我们前期的工作揭示了多种蛋白激酶在卵子发生、成熟和受精中的作用，最近发现蛋白磷酸酶PP2A的结构亚基敲出及其抑制蛋白的过表达均造成小鼠卵母细胞减数分裂染色单体提前分离，引起雌性生育力下降。本研究将主要采用卵母特异性基因剔除技术，结合组学分析、生化技术和活细胞观察等，在体研究蛋白磷酸酶2A亚家族成员PP2A、PP4、PP6等在卵泡发育、卵母细胞减数分裂成熟及早期胚胎发育中的作用，尤其在原始卵泡库维持、两次减数分裂阻滞/启动、染色体分离和受精卵发育中的作用，并揭示它们的上游调节物和下游作用底物及相关信号转导通路，深入了解卵子发生和成熟的调节机制，为不孕不育和出生缺陷成因的挖掘及疾病的预防和治疗奠定基础。

蛋白磷酸酶在控制蛋白质磷酸化及细胞生命活动中发挥关键作用，但其在雌性生殖细胞发生、成熟和受精中的作用了解很少。本项目将采用卵母细胞特异性条件基因剔除技术，在体研究PP2A类家族成员在卵泡发育、卵子发生和卵子减数分裂中的作用，尤其在原始卵泡库维持、生殖细胞减数分裂、染色体分离和受精卵发育中的作用，并揭示它们的上游调节途径和下游作用底物及相关信号转导通路。为了研究PP2A-Aα在卵泡发生和卵母细胞成熟中的作用，我们利用Cre-LoxP条件敲除系统特异在卵母细胞中敲除Ppp2r1a基因的外显子5-6，Ppp2r1aF/F；GCre+小鼠MII卵母细胞染色体排列紊乱和纺锤体形状异常，着丝粒黏连素的丢失而导致姐妹染色单体提前分离，造成非整倍性卵子产生，生育力严重下降。利用CRISPR/Cas9技术构建了卵母细胞特异性Ppp4c条件敲除小鼠，揭示PPP4c对雌性小鼠的生育能力至关重要。Ppp4cfl/fl;Gdf9-Cre 小鼠早期胚胎DNA损伤，DNA损伤检查点激活，造成胚胎发育阻滞和不育（投稿中）。利用Cre-LoxP系统条件敲除Ppp6c基因第2-4个外显子，Ppp6cF/F；ZCre+受精卵没有明显的原核形成，或有多个纺锤体，或形成多个小原核，早期胚胎发育阻滞，致使雌鼠生育力低下。Ppp6cF/F; GCre+的雌鼠完全不育，PP6c缺失导致原始原始卵泡激活受阻和激活卵泡生长受限，造成卵巢早衰，Lkb1敲除可以部分挽救PP6c敲除小鼠卵巢内卵泡发育的表型。研究揭示，在卵母细胞第一次减数分裂前期的漫长阻滞过程中，PP6在保护基因组完整性上发挥了关键作用。我们也将PP6Flox/Flox 小鼠与Stra8-Cre小鼠交配，制备了PP6在雄性小鼠生殖细胞减数分裂过程中特异敲除的小鼠模型，敲除PP6的小鼠不育，精子发生阻滞在粗线期精母细胞阶段。Ppp4cflox/flox;Strs8-Cre雄性小鼠也不育，PPP4C的敲除不影响精子形成但细胞质残余物附着尾部中段，导致小鼠不育。相关研究成果已在Cell Death Differ、PLoS Genet、J Cell Sci、Mol Hum Reprod发表论文8篇，另有3篇正在撰稿和投稿。相关研究结果对于深入了解生殖细胞发生、减数分裂、及胚胎发育调节机制提供了重要资料，也为不孕不育和出生缺陷成因的挖掘和疾病的预防和治疗奠定了基础。