基于RANK调控及μCT成像技术的续断酒炙治疗骨质疏松症作用机理研究

The effect of wine-processed Dipsacus asper on strengthening the bones and muscles had been recognized by the ancient physicians,but it still lacks modern supporting evidence. On the basis of previous studies, we propose the following hypothesis: dissolution rate of phenolic acids and saponins were increased after wine-processing, which may elevate serum OPG levels, block RANKL binding with osteoclast precursor cell surface receptor RANK, inhibit downstream activation of transcription and expression of NF-κB pathway, and prevent osteoclast differentiation or maturation and reduce bone resorption, thereby strengthening the bones and muscles. This project focused on the varied components, applied UPLC-MS/MS to monitor the dynamic change and tissue distribution of theses varied components, used ELISA, Western Blot, RT-PCR and other molecular biology techniques to evaluate the RANKL level, the protein phosphorylation levels in NF-κB signaling pathway, gene expression of osteoclast precursor cells, employing μCT image technology to analysis the bone of model rats. In summary, this project aimed to clarify the enhanced effect of strengthening the bones and muscles of wine-processed Dipsacus asper from animal, tissue, 按and cellular level.

续断酒炙具有增强强筋骨之功效，但其作用机理尚缺乏现代科学依据支撑。在前期研究基础上，我们提出以下假说：续断酒炙后酚酸和皂苷类成分溶出率升高，通过调控OPG/RANKL/RANK偶联系统，抑制下游NF-κB通路的激活及破骨基因的转录和表达，从而产生增强强筋骨的功效。本项目以续断酒炙前后变化成分为研究重点，应用UPLC-MS/MS技术研究酚酸和皂苷类成分的动态变化及肝肾分布，同时使用ELISA、Western Blot及RT-PCR等分子生物学技术，系统研究续断酒炙前后对骨质疏松大鼠血清OPG、RANKL和RANK水平、破骨前体细胞NF-κB信号通路蛋白磷酸化水平及相关分化基因表达水平的影响，使用μCT成像技术分析骨质疏松模型大鼠治疗后骨质的变化，从整体、组织及细胞分子水平，揭示续断酒炙增强强筋骨作用的科学内涵。

酒炙是中药炮制中最为常见的一种炮制方法，续断酒炙具有增强强筋骨功效，但其作用机理尚缺乏现代科学依据支撑。本项目的实施验证了如下假说：续断酒炙后酚酸和皂苷类成分溶出率升高，通过调控OPG/RANKL/RANK偶联系统，抑制下游NF-κB通路的激活及破骨基因的转录和表达，从而产生增强强筋骨的功效。酒炙后4-咖啡酰奎宁酸、3-咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、马钱苷酸、马钱苷、獐牙菜苷及续断皂苷VI的药时曲线下面积值，以及马钱苷酸、马钱苷、续断皂苷B及续断皂苷VI的峰浓度值显著增加，酒炙能明显改变6种主要成分在大鼠体内的分布，其中各成分在肝与肾组织中的分布增加。建立的酒续断多成分定量分析方法，可以为酒续断饮片的质控提供依据。建立的酒续断入血成分监测方法，可以为酒续断的临床应用提供借鉴。OPG由成骨细胞分泌，OPG能与RANK竞争结合RANKL，抑制破骨细胞的成熟分化，生、酒续断灌胃给药均能提高OPG水平，降低RANKL水平，表明续断具有抑制破骨作用。生续断和酒续断具有成骨和破骨双向调节功能，维持体内成骨和破骨活动的平衡，另外，酒续断的调控力度大于生续断。RAW 264.7巨噬细胞可以在RANKL的刺激下分化为破骨细胞，表现为TRAP阳性多核破骨细胞数量增加和TRAP活性增强。TRAP染色是评估破骨细胞形成的方法。生续断和酒续断提取液均剂量依赖性降低多核TRAP阳性细胞数目和TRAP活性。而MTT分析发现酒续断提取液对破骨细胞的抑制作用并非由于细胞毒性，因为酒续断不影响细胞活力，而生续断提取液对细胞活力影响较大。酒续断提取液能显著提高细胞中RANK mRNA的表达，降低分化特异性基因TRAP、MMP-9 和Cathepsin K mRNA的表达，调控力度比生续断提取液更强。抑制NF-κB信号通路激活可阻断破骨细胞生成并防止体内炎症性骨破坏。本研究为骨质疏松症提供了新的治疗思路。