阻断Hedgehog通路对氟致骨骼损伤的影响及分子机制

It was considered as a significant mechanism of skeletal fluorosis that the balance of bone formation and bone obsorption was damaged and bone conversion was accelerated. Skeletal fluorosis may lead to joint dysfunction.The role of Hedgehog(Hh) in bone formation has been concerned for years. Numerous studies showed that Hh was a critical factor which can induction the expression of osteogenesis transcription factors increased in the process of osteoblast differentiation. The program is based on previous research foundation that bone injury caused by fluorosis, such as Wnt, PI3K, NF-кB and P38 signaling pathway. The expression and significance of Hh in skeletal fluorosis was studied in the osteoblasts acquired by laser microscopic cutting technology, laser confocal microscope, real-time polymerase chain reaction, fluorescence in situ hybridization and immunohistochemical. The specificity inhibition of this signaling pathway was used to study the blocking effect of skeletal fluorosis. The changes of osteoblasts, golgi apparatus, endoplasmic reticulum, mitochondria and the concentration of Ca2+ can be observed by the laser confocal microscope. The further study of the relationship between the changes in osteoblasts with fluorosis and the Hh pathway can offer theoretical basis of bone injury's mechanism in endemic fluorosis and target drug's selection.

"骨形成和骨吸收平衡破坏，致骨转换加速"被认为是氟骨症发生发展的一种重要机制，可造成骨骼损伤导致骨关节功能障碍。刺猬蛋白（Hedgehog，Hh）在骨形成过程中的调节作用近年来备受关注。大量研究证实，Hh在成骨分化过程中作为一个关键性的因子来诱导成骨转录因子的表达增加。本项目在前期对氟中毒骨骼损伤的Wnt通路、PI3K通路、NF-кB通路及P38通路等的研究基础上，应用激光显微切割大鼠成骨细胞，结合培养细胞，运用激光共聚焦显微镜、实时荧光定量PCR、荧光原位杂交及免疫组化等技术探讨Hh在氟骨症中的表达意义，并应用针对该通路的特异性阻断剂深入研究Hh在氟骨症的作用机制；同时观察成骨细胞的形态学和高尔基体、内质网及线粒体等形态学的变化，以及细胞内Ca2+浓度变化，深入探讨氟致成骨细胞形态改变与Hh通路间的关系，以期为地氟病骨骼损伤发生机制及靶点药物选取提供理论依据。

地方性氟中毒是全球影响最广泛、最严重的地方病之一。我国对地方性疾病防治工作十分重视。但由于地氟病发病机制不清，至今尚无特效疗法。因此研究氟中毒发病机制对氟中毒的治疗及防治起关键作用，将具有重大的科学意义和实用价值。.目前氟中毒的发病机制的学说有很多，如氧自由基学说、蛋白改变学说、细胞凋亡学说、胶原蛋白学说、脂质代谢学说、钙磷代谢学说等。这些假设都未能全面阐释氟骨症多种临床表现的发病机制。本课题组紧密结合贵州氟病区发病情况，受国家自然科学基金项目资助，从2013年开始从细胞信号通路方面研究氟中毒的发病机制。在采用饮水加氟成功复制慢性氟中毒动物和体外培养染氟细胞的基础上，应用原位杂交、RNA干扰技术、real-time PCR、Western blotting、免疫组化、流式细胞术等先进的技术方法，主要研究与氟中毒主要靶点器官组织损伤有关的多条通路、多个分子的变化，重点关注信号转导通路相关分子在氟中毒骨相与非骨相损伤发生机制中的作用。.研究了慢性氟中毒大鼠骨、软骨、肝脏、肾脏、睾丸以及骨骼微环境等器官组织中Hh信号通路、p38信号通路、PI3K/Akt信号通路、OPG/RANGK/RANKL通路、CaN/NFAT通路以及转录相关信号分子SPARCE、MMP-9、NF-кB及Cthrcl等的定位和表达量的变化，同时应用信号通路的特异性阻断剂，发现体内过量的氟可以引起器官或组织中相关信号通路分子的蛋白及其mRNA表达异常，特异性阻断剂有一定的阻断作用，缓解组织损伤的病理表现，对氟引起的器官或组织损伤有一定的保护作用，进一步阐明氟中毒发病机制中细胞信号通路的重要作用和可能机制。同时所观察的骨、软骨、肝、肾、睾丸等出现病理形态学改变。研究结果表明细胞信号转导通路的异常调节是慢性氟中毒发生发展过程中的重要环节之一，多条细胞信号转导通路通过网络调控，共同参与了氟中毒引起的组织损伤过程。.培养博士研究生1名并获博士学位；硕士研究生9名并获硕士学位；其中2名继续攻读博士学位。本成果第一完成人获贵州省教育厅颁发的“2015年度优秀硕士生导师”称号；研究生获校级优秀博士学位论文二等奖1项、优秀硕士学位论文一等奖2项、二等奖3项、三等奖1项。.发表论文27篇，其中SCI收录论文2篇，国内核心期刊19篇，会议论文2篇。.荣获2016年贵州省医学科技成果奖二等奖1项。