防控神经管畸形的五子衍宗丸中固有叶酸作用排除及有效单体成分配伍的研究

Neural tube defects (NTDs) is a kind of the high incidence of serious birth defects. Although the birth rate of NTDs is reduced through the intake of folic acid, but there are still 30%-40% of NTDs children which are not sensitive to folic acid. From the perspective of traditional Chinese medicine, NTDs belong to the category of inadequate natural endowment which the main reason is the deficiency of the kidney. Our early studies have shown that the prevention role of Wuzi Yanzong Pills in NTDs models induced by all trans retinoic acid (atRA) is higher than other prescription of tonifying the kidney and the role of Wuzi Yanzong Pills on anti-apoptosis and proliferation is higher than the role of folic acid in PC12 cells induced by atRA. What is the result of the comparison of Wuzi Yanzong Pills and folic acid in NTDs? So the project focus on two questions. The first question is the comparison of Wuzi Yanzong Pills eliminated natural folic acid and folic acid in NTDs. The second question is the study of the effective monomers compatibility derived from Wuzi Yanzong Pills which is elected by reference to Chinese Pharmacopoeia. The implementation of the project will provide the theoretical and clinical basis for the prevention of NTDs by traditional chinese medicine.

神经管畸形（NTDs）是一种发病率高的严重性出生缺陷。虽然目前叶酸推广使NTDs的出生率降低，但仍有30%～40%的NTDs患儿对叶酸干预性作用不敏感。NTDs属于中医先天禀赋不足范畴，肾精亏损为其主要原因。五子衍宗丸补肾益精，理论上恰对证NTDs胎儿的先天禀赋不足之源。前期研究显示，五子衍宗丸预防全反式维甲酸（atRA）诱导的NTDs动物模型的作用高于其他补肾方剂的作用；另用五子衍宗丸含药血清和叶酸分别干预atRA诱导的PC12细胞，发现五子衍宗丸抗凋亡和促增殖的作用均高于叶酸的作用，那么五子衍宗丸与叶酸比较在预防NTDs方面的作用如何？所以本项目重点解决两个问题：一是排除五子衍宗丸中固有叶酸的影响，比较五子衍宗丸、叶酸对NTDs的防控作用；二是对五子衍宗丸中各有效单体成分进行配伍研究（单体的选择参照《中国药典》）。本项目的实施将为中医补肾方剂防治NTDs提供理论和临床依据。

研究背景：神经管畸形（NTDs）是全球婴儿死亡和残疾的最主要原因。NTDs属于中医先天禀赋不足范畴，肾精亏损为其主要原因。前期研究显示，补肾方剂五子衍宗丸（WYP）预防全反式维甲酸（atRA）诱导的NTDs动物模型的作用高于其他补肾方剂的作用。. 主要研究内容：应用HPLC-MS技术测定WYP中的叶酸（FA，临床唯一预防NTDs的药物）含量，在此基础上进行下一步实验，在细胞水平上比较排除FA干扰的WYP和FA对atRA诱导的CHO细胞和CHO/dhFr-细胞凋亡的影响，并观察氧化应激指标的变化，在动物水平上比较排除FA干扰的WYP和FA对NTDs的小鼠防控作用，并观察氧化应激指标、PI3K/Akt信号通路、凋亡等指标的变化；应用HPLC-MS技术测定WYP中金丝桃苷、毛蕊花糖苷、山柰素、五味子醇甲、鞣花酸五种主要单体成分含量（单体的选择参照《中国药典》），在此基础上设计五种单体不同配伍方案，观察不同单体配伍方案对NTDs的防控作用，并筛选出预防NTDs五种单体复合物的最佳配伍比例，并观察其氧化应激指标的变化。. 结论和意义：WYP中未检测出FA，说明WYP对NTDs的防控作用与FA无关。细胞水平上，WYP可以有效降低atRA诱导的CHO细胞和CHO/dhFr-细胞的凋亡率，提升细胞的抗氧化水平，其作用效果不仅优于FA，而且atRA诱导的CHO/dhFr-缺陷性细胞的实验结果进一步说明WYP的作用与FA无关。动物水平上，与FA预防NTDs的作用相比较，已经排除FA干扰的WYP的预防NTDs发生率明显降低、凋亡显著下降、PI3K/Akt信号通路明显激活、抗氧化水平显著提高。以上充分说明了排除FA干扰的WYP防控NTDs作用优于FA。秉承“从方剂中来，到方剂中去”的理念，在明确WYP中含有金丝桃苷、毛蕊花糖苷、山柰素、五味子醇甲、鞣花酸单体的基础上，通过单体的16种配伍方案的大规模的动物实验，成功筛选出最佳单体配伍，且其作用显著优于传统方剂WYP，更优于FA。项目的结论将为传统方剂和中草药单体成分配伍防治NTDs提供理论和临床依据，提升我国中医药防治地方病的科技水平。