宿主蛋白SP100抑制人类单纯疱疹病毒I型建立复制中心的分子机制的研究

Human simplex virus type 1 (HSV-1) is among the most studied viruses in Herpesviridae. It infects human hosts and causes a lifelong disease. The global serum positivity estimated for HSV-1 is around 67% as in 2012. HSV-1 does not only cause fever blisters around the mouth and lips, but also causes severe diseases such as herpes simplex virus encephalitis (HSE) and herpes simplex keratitis (HSK), which may result in blindness. The common anti-herpesvirus drugs in use are nucleoside or nucleotide analogues, with frequent incidence of leading to drug-resistant virus strains during clinical administrations, especially in immunosuppressed or immunocompromised patients. Based on the previous finding that "SP100, a major component of PML body, suppresses replication and the assembly of HSV-1 replication compartments", our group is proposing to investigate the molecular mechanisms of SP100's inhibition on the assembly of HSV-1 replication compartments through 1. establish permanent expression cell lines of different SP100 isoforms, various SP100 protein modification site mutants and SP100 SIM motif mutant on the background of the previously constructed human SP100-/- cells and compare replication and the assembly efficiency of HSV-1 replication compartments in those cell lines; 2. compare the replication of a recombinant HSV-1 over expressing SP100 to wild type HSV-1 in mice. These findings may further shed lights on the general controlling mechanism of host cells on viral/foreign DNA replication and provide new targeting sites for development of anti-herpesvirus drugs.

人类单纯疱疹病毒I型（HSV-1）是疱疹病毒家族中研究最为广泛和深入的模式病毒之一，终身潜伏于人体宿主并伺机复发。HSV-1在全球的感染率达67%(2012年)，除引起口唇疱疹外，还能引起脑膜炎、致盲性结膜炎等。目前抗疱疹药物主要为核苷（酸）类似物，临床耐药株在免疫抑制病人中频繁出现。本项目在"PML小体主要成分蛋白SP100能抑制HSV-1在核内建立病毒DNA复制中心"的前期工作基础上，希望通过1.在人源SP100-/-单克隆细胞系中稳定表达SP100各剪接异构体、蛋白修饰位点突变体及SIM Motif突变体等，并分析HSV-1在这些细胞系中的复制情况；2.研究过表达SP100蛋白的重组病毒在动物体内中的感染情况；探索SP100抑制HSV-1建立病毒复制中心的分子机制，寻找以HSV-1为代表的疱疹病毒在核内组织DNA复制中心的分子基础，开发抗病毒复制新靶点，为新药研发提供崭新平台.

本项目希望基于前期的研究，深入探索PML小体固有成分 Speckled protein 100 (Sp100)各亚型蛋白的抗病毒功能及具体分子机制。经过4年的项目执行期，课题组不仅阐明了Sp100各个亚型在抗HSV-1病毒感染方面的不同功能和作用机制，还在解析 Sp100 蛋白介导一型干扰素建立抗病毒天然免疫的分子机制方面有了突破性进展：.1.明确了Sp100蛋白的特异亚型Sp100A在HSV-1感染过程中发挥抗病毒效应的作用途径。本项目的研究结果揭示在HSV-1活跃复制过程中，细胞核内的Sp100蛋白被病毒高效降解，但宿主细胞胞质中的Sp100A蛋白则通过外泌体的形式向被感染细胞外运送。胞外囊泡结构中的Sp100A蛋白能被未感染细胞有效接收，并抑制HSV-1病毒对这些细胞的侵染。.2.详细阐述了Sp100蛋白的特异亚型Sp100A发挥抗病毒效应的具体分子机制。本项目发现 Sp100A 具有广泛抗病毒作用。进一步研究结果显示胞质中的 Sp100A是包括病毒感染、IFN、EGF、GDNF等在内的多种胞外刺激因子的直接反应者。IFNβ 通过激活PI3K通路，诱导 Sp100A 蛋白在其188位上的丝氨酸发生磷酸化修饰，从而加强了 Sp100A 与PKM2的相互作用，并通过ERK1/2-PKM2-PIN1-importin转运复合物促进其向细胞核输入。在细胞核中，IFNβ 作用下的 Sp100A 富集在关键抗病毒干扰素刺激基因(Interferon stimulated genes, ISG)的启动子区域，如 IFI16、OAS2、RIG-I 等，并激活他们的转录。.综上所述，本项目证实了PML小体固有成分Sp100 (Speckled protein 100, Sp100)的一种主要异构体 Sp100A在HSV-1裂解复制过程中，借由外泌体途径从感染细胞的胞质溶浆中加速向胞外分泌，并进入到未感染细胞中，发挥积极的抗病毒作用。这些胞质中的Sp100A能响应多种胞外和胞质内刺激（病毒感染、IFN、EGF、GDNF等）向核内运输，并转录激活关键抗病毒ISG。这些发现或许也揭开了核内功能小体 PML 小体对细胞质中微环境变化的感应与效应机制的冰山一角，进一步明确 PML 小体的工作机制提供了新视角，同时也为以 PML 小体及干扰素通路为靶点发掘新型抗病毒药物提供了理论基础。