在Epstein-Barr病毒感染的B细胞激活转化中PD-1的甲基化调控和免疫抑制功能

PD-1 play an important role of immunosurppession in T cells from the Epstein-Barr virus (EBV)infected individual.Based on the data that the expression of PD-1 gene in EBV positive B cells was upregulated,EBNA-1 dependant methylation downregulated,and on the observation of the physical interaction between EBNA-1 and DNMT3B protein(IP) ,and EBNA-1 on the PD-1 promoter(CHIP),we hypothesize that EBNA-1/DNMT3B mediated PD-1 methylation negatively regulates PD-1 gene expression, and thereby further impacts on the immune response of EBV infected B cells.We propose to analyze PD-1 methylation and expression,B cell differentiation and Ig change,production of B cell-derived factors in EBV infected primary B cells and LCLJul,BL41 cells, via RNA interference,gene overexpression and use of inhibitors of methylation transferases in order to gain a better understanding of PD-1 methylation and its physiological functions. We will further investigate the EBNA-1/DNMT3B binding to the promoter of PD-1 and regulation of its methylation in 293T and LCLJul cell lines through chromatin immunoprecipitation, Luciferase reporter technique and techniques stated above. Those efforts may reveal novel targets for drug development in the treatment of EBV-related B lymphomas.

在EB病毒感染的宿主T细胞中PD-1发挥其免疫抑制功能。本项目基于观察到在EBV阳性B淋巴细胞中PD-1基因表达上调、EBNA-1依赖的PD-1甲基化水平下调及EBNA-1分别与DNMT3B蛋白和PD-1启动子序列相互作用的基础上,拟通过EBV感染的外周血B淋巴细胞、LCLJul、BL41细胞模型，采用RNA干扰、基因过表达技术，以PD-1甲基化及其表达、B细胞分化与Ig类转化、细胞因子表达为主要指标，观察PD-1基因甲基化特征及在B细胞中生理功能；以293T和LCLJul为对象，采用染色质免疫共沉淀、Luciferase报告基因和前面提及技术手段，确证EBNA-1/DNMT3B结合到PD-1启动子区并调控其甲基化；以论证在EB病毒感染的B细胞中，EBNA-1/ DNMT3B介导的PD-1甲基化负调控其表达，进而调控其在B细胞中功能的假说；以期探寻治疗EBV 诱发B淋巴瘤新的药物靶点。

Epstein-Barr 病毒感染的B 细胞激活转化中PD-1 的甲基化调控和免疫抑制功能,本课题用Epstein-Barr病毒感染人外周血B细胞，建立EBV 阳性的永生化B细胞，结合运用蛋白,生物化学，细胞分子生物学等方法和技术，对PD-1在EBV感染的B细胞进程中，EBNA-1和DNMT3B调控其表达，甲基化以及B细胞转化特征进行了初步研究。首先通过分离出健康人外周血单核细胞，然后通过EBV重复感染建立了能连续生长的B细胞，发现了PD-1的mRNA,蛋白随EBV感染的时间变化出现波动性变化，同样其启动子甲基化也呈现出波动变化；在此结果之上，我们发现当通过shRNA干扰 EBNA-1和DNMT3B其表达，PD-1表达和甲基化水平提高了;反之，当过表达ENBA-1和DNMT3B， PD-1的表达和甲基化水平降低，说明PD-1的表达和启动子甲基化具有EBNA-1和DNMT3B依赖性。之后，我们通过染色质免疫共沉淀分析了EBNA-1以及DNMT3B在PD-1启动子上的结合区域，结果表明EBNA-1和DNMT3B结合区域重叠且位于F1/R1的序列区，说明其主要通过调控PD-1甲基化来调控其表达；最后我们分析siRNA介导的PD-1表达下调，发现记忆B细胞(CD27+CD38-)数量显著减少，而其它细胞亚型包括静息B细胞(CD27-CD38-)、浆细胞前体(CD27+CD38+)和浆细胞(CD27-CD38+)影响不大，且在甲基化转移酶抑制剂处理的情况下，记忆亚型B细胞数量不管PD-1敲除与否均明显减少。同时对细胞因子转录水平进行分析，发现白激素IL-8以及肿瘤转化生长因子TGF-beta受PD-1以及甲基化转移酶抑制剂处理敏感，都显著下调。其它相关研究还正进一步研究中。综上所述，本研究为了解EBV感染的B细胞中PD-1的表达调控分子机制奠定了坚实的工作同时对PD-1在EBV介导的B细胞转化分化中的功能提供了重要的启示性线索。项目资助发表SCI论文1篇，待发表SCI论文1篇，核心期刊1篇。培养硕士生2名，其中一位已经取得学位。项目投入经费23万元，支出18.0771万元，各项支出除了文献出版费高出一点外与预算基本相符。剩余经费4.9229万元，剩余经费计划用于本项目的后期研究。