基于LAMP技术检测农产品中转基因组分新方法的研究

GMO detection of agro-products is importance to safe and standardized manage GM industry. LAMP (loop-mediated isothermal amplification) has higher sensitivity than PCR by 2-3 orders of magnitude and is a isothermal amplification technique to DNA without PCR instrument. This project will analyze LAMP primer design parameters, simplify specific primers screening process and optimize the LAMP primer design system, based on it, we will design and screen LAMP primer to detect typical transgenic component and reference gene. Based on SYBR Green and HNB staining, liquid LAMP method will be established. At same time, based on chemiluminescent and near-infrared fluorescence, solid LAMP method will be built. Above of all, it is to realize visual qualitative detection and of high-sensitivity, high-throughput, quantitative detection the transgenic component of crops.

农产品转基因检测是对转基因产业进行安全规范管理的重要内容。LAMP（环式介导的等温扩增）是一种比PCR灵敏度高2-3个数量级且无需PCR仪的DNA等温扩增技术。本项目将在分析LAMP引物设计参数，简化特异性引物筛选过程和优化LAMP引物设计体系的基础上，设计并筛选出检测典型转基因组分及内参基因的LAMP引物，建立基于SYBR Green和HNB染色的液相LAMP方法，以及基于化学发光和近红外荧光的固相LAMP方法，实现对农作物转基因成分可视化定性检测及高灵敏、高通量定量检测。

对于转基因成分的检测，主要依赖定性定量PCR检测，而PCR技术也存在不足，如易造成假阳性、检测单一（每次只能扩增一种外源基因）、灵敏度有待提高、通量低、需要特定PCR仪器、多引物退火不一致时工作量加大、结果需要琼脂糖-EB检测，引起EB环境污染问题等。然而本研究的环式等温扩增LAMP技术具有快速、不需要特性仪器、直接肉眼观察结果等优点，开始在转基因检测工作中应用。. 本项目主要探索LAMP技术中引物设计的最佳参数，并以此对转基因组分检测新方法进行研究，其中包括筛选LAMP特异性引物，优化LAMP可视化检测的反应体系；包括以下内容：LAMP引物设计参数确定； LAMP引物确定、筛选；可视化LAMP检测条件的优化； 建立LAMP高通量检测转基因组分方法。主要建立了大豆内参基因Lectin和玉米内参基因zSSIIb的LAMP检测技术，确定了最佳的扩增温度、dNTP浓度，同普通PCR比较了LAMP引物的特异性；建立了快速检测转基因大豆转化体GTS40-3-2的LAMP新技术，并对外源基因NOS、bar、Bt等基因的LAMP引物组和检测体系进行探索和建立；构建了可以替代转基因阳性基质的标准质粒分子，有利于对LAMP技术的特异性和灵敏性进行分析。而该方法可以实现定量、高通量检测，极大地提高了效率、节省人力物力，同时可批次检测样品，便于出入境等政府部门对转基因成分的检测。这也为以后转基因检测提供更多可选的检测方法，可更好地丰富国内现有的转基因检测标准。