甜瓜果实LOXs的克隆及其在直链酯类合成中的作用与表达调控

Lipoxygenases (LOXs, EC 1.13.11.12) are widely distributed in the plant kingdom with multiple isoforms, and with diverse functions and regulation mechanism among members. It is uncertain that if LOXs involved in aliphatic esters synthesis in oriental sweet melon. In this project, highly aromatic cultivar of melon will be used to construct a full-length cDNA library of climacteric stage with SMART ( Switching mechanism at 5′end of RNA transcript) technique. In order to get full length of LOXs, homology-based cloning and expressed sequence tag by Genbank searching, and RACE (Rapid amplification of cDNA ends) strategy combine with cDNA library will be used. To explicit the role of LOXs in aliphatic esters synthesis, pulp disk incubation of the same stage will be conducted; two substrates linoleic and linolenic acid and inhibors of n-PG and NDGA of LOX pathway will be added in the incubation buffer, respectively, LOX enzyme activity and gene family members expression and aroma volatiles will be investigated. Meanwhile, to understand better the role of LOX genes during fruit development, their expression will be monitored during plant and fruit development and also in different flavor melon cultivars. At last, the regulation of ethylene, methy jasmonate and low temperature of storage after harvest on LOX enzyme and genes expression in melon fruit will be tested. It's important to clarify the role of LOX genes involved in aliphatic esters synthesis in oriental sweet melon from molecular level; and also to establish the foundation to further study the functions of genes and regulate the flavor quality of melon fruit using molecular approaches.

脂氧合酶（LOX）在植物中以多基因家族存在，且家族成员(LOXs)间存在功能和调控机制上差异。LOXs是否参与薄皮甜瓜直链香气物质合成尚未定论。项目拟以香气浓郁薄皮甜瓜为试材，利用SMART技术构建果实乙烯释放高峰期全长cDNA文库，利用同源克隆和甜瓜LOX基因的EST，通过RACE和文库结合，获得LOXs基因全长。为了明确LOXs在甜瓜果实直链酯类合成中的作用。添加外源亚油酸和亚麻酸等直接前体和专用抑制剂n-PG和NDGA，进行果肉圆片孵育实验。同时，为了更好地理解该基因家族在果实成熟过程中的作用，进行基因的时空表达分析以及在不同风味品种甜瓜上表达验证。最后研究采后甜瓜的乙烯、茉莉酸甲酯和低温贮藏等外界条件对酶和基因表达的调控。对于从分子水平阐明LOXs在薄皮甜瓜直链香气物质形成的作用有重要意义，也为进一步研究基因的功能和利用分子手段调控甜瓜果实香味品质奠定基础。

脂氧合酶（lipoxygenase, LOX）是生物体内广泛分布的一类含有非血红素的铁蛋白，专一催化含有顺，顺-1 , 4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸加氧反应。在植物中，LOX以多基因家族存在，广泛参与生长发育、果实成熟衰老及香气物质合成等。利用2012年释放的甜瓜基因组(http://melonomics.net)，以“lipoxygenase”为关键字进行搜索，最终鉴定出18个脂氧合酶基因家族成员，分别命名为CmLOX01-CmLOX18，这些成员均包含了典型的脂氧合酶保守结构域。利用生物信息学手段，将LOX基因家族分为三大类： typeⅠ9-LOX 型 (CmLOX07 和CmLOX09)， typeⅠ13-LOX型 (CmLOX01-06) 以及typeⅡ 13-LOX (CmLOX08，CmLOX10-16 和 CmLOX18)。取甜瓜的不同器官和花后不同天数的果实，利用半定量和实时荧光定量技术对18个基因家族成员进行了时空表达分析，发现不同成员在甜瓜不同器官和发育阶段表现不同，可能与其功能相关。克隆了4个薄皮甜瓜中重要的脂氧合酶基因家族成员（(CmLOX09 、CmLOX10、CmLOX13和CmLOX18)的cDNA全长，ORF分别为2697bp、2709bp、2721bp 和2916bp，分别编码881、902、906和907个氨基酸。. 利用在果实乙烯高峰期的果肉圆片实验，通过加入LOX途径的合成前体（亚油酸和亚麻酸）和抑制剂（n-PG和NDGA），证明脂氧合酶及CmLOX03、CmLOX05、CmLOX11~12、CmLOX16 和CmLOX18可能参与甜瓜果实直链香气物质的合成。以4种不同芳香类型的甜瓜为试材，研究了CmLOXs在甜瓜果实中的酶活性及基因表达，表明CmLOXs在不同芳香类型的薄皮甜瓜栽培种和变种中的表达有较大差异，而这种差异可能与其基因家族成员在香气物质合成中的不同作用有关。. 通过对甜瓜进行几种采后处理，明确了采后乙烯、MeJA、乙醇及低温贮藏等对甜瓜脂氧合酶基因家族成员CmLOX03、 CmLOX09和 CmLOX18的表达调控作用。. 发表相关论文7篇，其中SCI收录6篇，中文核心期刊1篇。获得国家发明专利1项。培养博士生2名，硕士研究生3名。