微囊藻毒素MC-LR经PP1-CREB途径致精子生成障碍的研究

Spermatogenic failture is the main cause factor of male reproduction dysfunction and among numerous environmental factors, whether the microcystin-LR (MC-LR) exposure through drinking water is a great inducement is still unknown. We found high concentration of MC-LR still can be detected from finished water under existing water purification process, the internal exposure level of MC-LR in the serum and urine from the corresponding region population is significantly higher than the 50% inhibition concentration of MC-LR inhibits the activity of protein phosphatase 1 (PP1) and PP1 is involved in the regulation of spermatogenesis. Bioinformatics analysis found that PP1 can regulate spermatogenesis through the dephosphorylation of cyclic AMP Response element-Binding protein (CREB). In this study we will first establish the correlation between MC-LR internal exposure level and PP1 activity and spermatogenic failture through epidemiologic study; and then verify the correlation between MC-LR exposure and PP1 activity, the phosphorylation level of CREB and spermatogenic failture by animal testing; and finally illuminate the mechanisms of MC-LR cause spermatogenic failture from several different levels including MC-LR exposure, overexpression of PP1 and silent of CREB, through cell experiment. The achievement of this study will provide experiment data support for health risk assessment of MC-LR exposure through drinking water and etiology clues for clinical male infertility caused by spermatogenic failture.

精子生成障碍为男性生殖功能障碍的最主要因素，在诸多环境危险因素中，经饮水途径微囊藻毒素MC-LR暴露是否是其一大诱因尚不清楚。项目组前期发现现有净水工艺下出厂水仍能检测出高浓度MC-LR，本地区人群血清和尿液MC-LR内暴露显著高于其抑制蛋白磷酸酶1（ PP1）活性的半抑制浓度，且PP1参与生精过程的调控；生物信息学分析发现PP1可通过介导环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）去磷酸化调控生精过程。本研究拟通过人群流行病学研究建立MC-LR内暴露与PP1活性、精子生成障碍的关联；采用整体动物试验验证MC-LR暴露与PP1活性、CREB磷酸化水平以及精子生成障碍的关联；采用体外细胞实验从MC-LR暴露、PP1过表达以及CREB沉默等层面阐明MC-LR致精子生成障碍的机制。本研究的完成将为饮用水MC-LR污染的健康风险评估提供实验数据支持，也将为精子生成障碍所致的临床男性不育症提供病因线索。

水源水藻类污染以及现有净水工艺的局限性，造成人们经饮水途径长期低剂量微囊藻毒素-LR（MC-LR）暴露。已有研究表明，大剂量的MC-LR造成精子生成障碍、精液质量下降和睾丸损伤，然而，长期低剂量MC-LR暴露（经饮水途径，人群主要暴露方式）对雄性生殖功能尤其是精子生成障碍的影响尚未见报道。本项目首先建立了适用于饮用水MC-LR检测的液相色谱质谱联用法（LC/MS/MS）以及适用于血清和尿液MC-LR检测的时间分辨定量荧光纳米微球免疫层析法并应用于后续饮用水和人群血清样本检测，发现无锡地区饮用水MC-LR浓度为（0.036±0.016）µg/L、人群血清MC-LR浓度为（0.007-1.725） µg/L。基于检测结果开展的人群MC-LR暴露水平、蛋白磷酸酶1（PP1）活性以及精液质量的相关性分析发现，血清MC-LR水平与红细胞PP1活性、精子密度、精子总数等呈负相关关系；MC-LR暴露增加精液质量异常的风险，且暴露浓度越高，风险越大；MC-LR暴露与精液质量呈负相关，且暴露浓度越高，精液质量越差。基于饮用水MC-LR污染水平，设置0.01、0.20和4.00 µg/kg/Day三个剂量组对4周龄ICR雄性小鼠进行连续60天灌胃染毒，染毒期间各组间体重增长情况无显著差异，但是在染毒后期（40～60天）高剂量组小鼠体重略低于其他各组，小鼠睾丸和附睾的脏器系数、组织切片HE染色无显著性差异，睾丸组织细胞凋亡原位检测（TUNEL）结果显示低剂量组（0.01µg/kg/Day）和高剂量组（4.00µg/kg/Day）存在初级精母细胞凋亡的情况，CASA精液质量分析结果显示高剂量组小鼠精子密度显著低于对照组（p=0.023），虽然生物信息学预测结果显示，MC-LR可能通过抑制PP1活性、调节转录因子CREB表达水平，进而调节精子生成相关基因的表达水平而影响精子生成，但是进一步实验结果显示染毒小鼠睾丸组织PP1活性及CREB表达水平在各组间无显著差异，不同染毒剂量的GC-2细胞PP1活性及CREB表达水平也无显著差异。上述结果表明，MC-LR暴露与精子生成障碍之间存在关联，虽然动物试验和体外实验未能验证生物信息学预测的PP1-CREB作用机制，但也将为环境暴露与精子生成障碍相关研究提供了参考。