基于FXR肝脏修复机制的补骨脂毒性研究

Fructus Psoraleae and its compound preparations are widely clinically used, but their clinical hepatotoxicity has been reported. Therefore, it is of great practical value to perform the toxicological study on Fructus Psoraleae. Nuclear receptor farnesoid X receptor (FXR) is a bile acid receptor. It has been reported that FXR mediates liver self-repair through autophagy and regeneration pathways in liver cells, while the damage of the self-repair function of the liver plays an important role in the poison-induced liver toxicity. In our previous work, we found Fructus Psoraleae can obviously inhibit FXR protein expression in liver cells, implying that Fructus Psoraleae may antagonize FXR to suppress the liver-repair process including hepatic cell autophagy and regeneration thus leading to liver toxicity. Therefore, we put forward this current research project. In the study, based on the established cell and animal models as well as the obtained results, we will carry out the research in the liver toxicity of Fructus Psoraleae by targeting the FXR-based liver repair mechanism using cell molecular biology and immunofluorescence techniques. It is expected that the obtained research results in the current project may not only provide scientific basis for rational uses of Fructus Psoraleae and its compound preparations, but also supply important theoretical data to the study on the function of liver-repair process in the exogenous toxicant-induced liver injury and the potential liver toxicity of FXR antagonist by using Fructus Psoraleae as a probe.

补骨脂及其复方制剂临床使用广泛，但临床报告显示其具有明显的肝脏毒性。因此，开展补骨脂毒理研究具有重要的实用价值。核受体法尼基衍生物X受体(FXR)是一种胆汁酸受体，可通过肝细胞自噬和再生途径介导肝脏自身修复作用，而肝脏自身修复的破坏在肝毒物诱导肝毒性过程中发挥重要作用。我们前期研究发现，补骨脂可明显抑制肝细胞FXR蛋白水平，提示补骨脂可能涉及拮抗FXR以抑制包括肝细胞自噬和再生的肝脏修复过程进而导致肝脏毒性。基于此，我们提出了本课题研究。在研究中，我们将基于已建立的细胞和动物水平模型以及取得的工作基础，采用细胞分子生物学、免疫荧光等技术手段开展基于FXR肝脏修复机制的补骨脂毒性研究。研究所取得的成果, 将不仅为补骨脂及其复方制剂的临床合理使用提供科学依据，同时也为肝脏自身修复过程在外源肝毒物导致的肝脏损伤中的作用探讨以及基于补骨脂为探针的FXR拮抗剂的可能肝毒性研究提供重要的理论素材。

补骨脂及其复方制剂临床使用广泛，但临床报告显示其具有明显的肝脏毒性。因此，开展补骨脂毒理研究具有重要的实用价值。核受体法尼基衍生物X受体(FXR)是一种胆汁酸受体，可通过肝细胞自噬和再生途径介导肝脏自身修复作用，而肝脏自身修复的破坏在肝毒物诱导肝毒性过程中发挥重要作用。我们前期研究发现，补骨脂可明显抑制肝细胞FXR蛋白水平，提示补骨脂可能涉及拮抗FXR以抑制肝细胞自噬进而导致肝脏毒性。基于此，我们提出了本课题研究。在本研究中，我们首先基于实验室已有的FXR受体拮抗剂筛选平台，利用哺乳动物单杂交实验和转录激活实验，在细胞水平筛获得多个具有FXR拮抗作用的单体。随后，我们纯化出带有his-tag的 FXR-LBD蛋白，通过Alphascreen技术检测补骨脂单体对FXR-LBD与其共激活因子SRC1相互作用的影响，在分子水平获得多个具有FXR拮抗作用的单体。最后，我们使用蛋白热稳定实验和微量热泳动实验，最终确定补骨脂二氢黄酮和新补骨脂异黄酮对FXR配体结合域具有直接结合作用，影响FXR的转录活动。综合以上实验结果，我们推测补骨脂二氢黄酮和新补骨脂异黄酮可能补骨脂主要毒性物质基础。因此，我们使用小鼠原代肝细胞和C57小鼠模型，从体内外水平对补骨脂二氢黄酮和新补骨脂异黄酮的肝脏毒性进行评价并探讨其作用机制。结果显示补骨脂二氢黄酮和新补骨脂异黄酮确实能导致小鼠原代肝细胞和C57小鼠肝脏毒性，且主要通过抑制FXR从而下调GSK3β/ULK1/mTOR抑制肝脏细胞自噬作用从而导致肝脏毒性。本研究阐明补骨脂的主要毒性物质并揭示其可能的毒性作用机制。本研究结果为补骨脂临床安全使用提供重要的理论信息，为其它作用于FXR受体的药物肝脏毒性机制研究提供有益的研究思路；同时为肝脏自噬作用在外源性肝毒物导致肝脏损伤中的作用研究提供重要素材。