真菌窗烷类杀虫活性倍半萜生物合成的研究

Fenestrane scaffold is one of the most unique chemical structures in Nature. Penifulvins, a family of fungal sesquiterpene with strong insecticidal activity, contains the complex Dioxa-[5.5.5.6]-fenestrane and the regioselective/stereoselective oxidations. However, the genetic and biochemical basis of penifulvins biosynthesis remains unknown. Herein, we try to identify and characterize of the penifulvin (Peni) biosynthetic gene cluster from Penicillium griseofulvum NRRL35584. Combination with gene knockout, chemical complement, protein expression and biochemical characterization and heterogeneous biosynthesis, the biosynthetic pathway of penifulvins will be investigated. The study on the biosynthesis of penifulvins are expected to uncover the special enzyme functions for silphinene synthesis, fenestrane scaffold formation as well as the regioselective and stereoselective oxidation in nature products, and discover some novel and remarkable sesquiterpene insecticides through pathway engineering.

窗烷结构是自然界中最特殊的化合物骨架类型之一。真菌倍半萜类天然产物penifulvins不但具有显著杀虫活性，而且结构中复杂的Dioxa-[5.5.5.6]窗烷结构和区域选择性/立体选择性的氧化修饰预示着独特的生物合成机制。通过对Penicillium griseofulvum NRRL35584的全基因组测序与生物信息学分析，结合基因敲除实验确定了penifulvin的生物合成基因簇。本项目拟利用基因敲除、化学回补、蛋白表达与体外生化表征、异源宿主生物合成等手段揭示penifulvin的生物合成途径，重点研究倍半萜合成前体silphinene、Dioxa-[5.5.5.6]窗烷结构和区域选择性/立体选择性氧化修饰的酶学合成机理。本项研究有望系统地揭示自然界中具有窗烷骨架独特结构类型的天然产物生物酶学途径，为实现不同窗烷类型的倍半萜类天然产物的途径工程改造从而获得新型杀虫生物农药奠定基础。

真菌来源的penifulvin和asperaculin具有独特的Dioxa-[5.5.5.6]窗烷环，是一类结构新颖且具有良好抗虫活性的倍半萜类天然产物。通过化学结构指导下的系统进化树分析并结合基因敲除策略，我们在陆生真菌P. griseofulvum中鉴定了penifulvin的生物合成基因簇peni。采用异源表达和酶体外生化表征，阐明了倍半萜环化酶PeniA催化线性前体法尼基化焦磷酸环化生成角三环型倍半萜骨架silphinene的环化机理。通过peniABC三基因的异源表达策略，在构巢曲霉中实现了penifulvin A的合成，揭示了从silphinene到Dioxa-[5.5.5.6]窗烷环构建的酶学途径与反应机理。以PeniA和PeniB为探针，通过基因组挖掘策略，在海洋真菌A. aculeatus中鉴定了asperaculin A的合成基因簇aspe。进一步的异源表达证明，penifulvin和asperaculin采用相同的合成前体silphinene去构建不同的Dioxa-[5.5.5.6]窗烷环，其中核黄素依赖的Baeyer-Villiger氧化酶PeniC和AspeB是两个化合物合成的关键分散点。进一步的酶体外生物表征，系统阐明了peni和aspe基因簇中的其他基因，如α-酮戊二酸依赖双氧化酶（PeniD/PeniF和AspeC/AspeD）和乙酰转移酶（PeniE）的催化功能。通过组合生物合成策略和α-酮戊二酸依赖双氧化酶突变体的应用，我们实现了窗烷环倍半萜人工结构衍生化合物库的建立。本研究的研究结果，揭示了窗烷环倍半萜的合成逻辑，所发现的生物酶为其他萜类化合物骨架的精准构筑以及结构衍生提供了新的催化工具。本项目相关内容总共发表6篇论文，包括Angew Chem Int Ed和ACS Catal等杂志。