长白山道地朝药肝炎草抗肝损伤最佳有效组分筛选及其协同作用机理研究

Potentilla viscosa J. Don, which is one kind of Korean nationality folk medicine that has been traditionally used to treat a variety of liver injury such as jaundice, hypochondriac pain and other symptoms, has a long and wide application history. Based on the confirmation of traditional experience and preliminary experiments, this project intends to use water as the extraction solvent to maximize the retention of effective components. And then, macroporous adsorption resin will be adopted to separate water extract and the separated parts will be screened using animal liver injury model to obtain effective part from which the components will be separated and their structures will be identified. By analyzing comprehensively the in vivo and in vitro fingerprints of the effective part, we will confirm the into-blood components and detect their activity of anti-hepatic injury. At the same time, attention will be paid to all components for possible synergistic effects among them to screen candidate components and further to optimal effective combined components by MTS assay combined with orthogonal experimental design. Then, a variety of technical means such as western blot analysis will be adopted in cell and animal experiments to research fully into optimal effective combined components and thereby clarify their mechanisms of synergistic effect of multiple components, multiple channels, multiple targets and multiple effects.

朝药肝炎草常用来治疗黄疸、胁痛等各种肝损伤症状，疗效显著，有广泛的民间应用基础。在传统经验和前期实验的基础上，本项目拟克服从植物水提液中分离化学成分的种种困难，继续以水作为提取溶剂研究肝炎草，以最大限度地保留药效成分。然后应用大孔吸附树脂等材料分离其水提液，采用动物肝损伤模型筛选出抗肝损伤有效部位并应用反相高效液相色谱等方法从中分离出化学成分并鉴定其结构。通过综合分析分别建立起来的有效部位体内、体外HPLC指纹图谱，确认入血化学成分并测定其抗肝损伤活性大小，筛选出直接和间接药效成分。然后通过多因素、多水平的正交试验设计并结合MTS法，进一步筛选出抗肝损伤作用最强的化学成分组合-“最佳有效组分”。最后，采用Western blot analysis等多种方法和技术手段，通过细胞和动物实验，从蛋白质、基因表达等多个层面，阐明最佳有效组分多成分、多途径、多靶点、多效应的协同作用机理。

中国朝医药学是中国传统医药学的重要组成部分之一。朝药肝炎草常用来治疗脂肪肝、胁痛等各种肝损伤症状，疗效显著，有广泛的民间应用基础。本项目证明肝炎草提取物对脂肪肝模型小鼠具有良好的改善作用，并且能够浓度依赖性地降低小鼠血糖含量。采用大孔吸附树脂、高效液相色谱等各种分离方法，对肝炎草水及乙醇提取物进行化学成分的分离及纯化。应用13C-NMR和MS等数据对化合物进行化学结构解析，鉴定了62个单体化合物（重复未计）。其中55个是首次从肝炎草中分离得到的，6个是自然界中的新发现的化合物。对58个单体进行了抑制脂质蓄积等肝损伤的筛选研究。油红O染色、TG含量测定等实验结果表明：肝炎草中的新化合物C1，C2，C3，C49和化合物C11，C12等11个化合物对3T3-L1前脂肪细胞的脂质蓄积具有良好的抑制效果。另外，对30个化合物进行了构效关系研究。Discovery studio分子模拟技术证明了新化合物C1等4个化合物可以与不同的氨基酸残基形成氢键、烷基或 pi-烷基，从而形成有效结合，激活AMPK或SCD1，从而发挥抑制脂质蓄积的作用。Western-Blot和RT-PCR实验表明，化合物C12和C1可能通过AMPK/ SREBP1c信号通路，调控AMPK及其下游SREBP1c、SCD1、FAS、PPARγ和CEB/Pα等蛋白或mRNA的表达，发挥抑制3T3-L1前脂肪细胞分化和脂质积蓄的作用。新化合物C1能够使脂肪肝模型小鼠血清中的TG、TC、LDL-C水平分别呈剂量依赖性的降低。同时，化合物C1能够显著降低小鼠血清中ALT，AST和IL-1β水平，对TY诱导的小鼠肝损伤具有一定的保护作用。H&E染色等小鼠肝脏组织病理形态学表明，化合物C1剂量依赖性地减轻小鼠肝脏的脂质蓄积。C1给药组剂量依赖性地显著提高了p-AMPK等蛋白的表达；同时，使肝脏组织中SREBP-1c等与脂肪生成密切相关蛋白的表达水平呈剂量依赖性降低。化合物C1有可能是通过AMPK/ SREBP1c信号通路抑制小鼠肝脏脂质蓄积。肝炎草通过多成分、多途径、多靶点、多效应的协同作用机理，达到显著的抑制脂质蓄积作用。