剪接相关蛋白SRP1在拟南芥热胁迫中的功能研究

High temperature is one of the severe abiotic stress factors in plants. It affects almost all aspects of plant growth, development and reproduction. Heat stress adversely affects crop production, which causes enormous economic losses worldwide. Therefore, understanding of the molecular mechanisms of heat stress response and tolerance in plants is of great significance in agriculture. To identify important genes in the plant heat stress response pathway, we employed a forward genetic screening for mutants showing altered expression of the luciferase reporter gene driven by the heat stress-inducible promoter of the heat shock protein gene Hsp18.2. From such genetic screenings, we obtained a mutant HL761 showing higher expression of the luciferase gene in response to heat stress. Further phenotyping revealed that the HL761 mutant is hypersensitive to high temperature stress. Genetic mapping combined with genome sequencing identified that the SRP1 gene encodes a protein related to mRNA splicing. From our preliminary results, we hypothesize that SRP1 confers heat tolerance perhaps through regulation of the target gene expression by modulating their splicing. This proposal aims to studying the expression of SRP1, identifying the interacting proteins of SRP1 and the target genes regulated by SRP1, and analyzing the changes of the transcription level and the splicing patterns of the target genes. Our proposed research shall help better understanding of the function and the mechanism of SRP1 in heat stress response and tolerance in plants.

高温是植物面临的越来越严重的逆境胁迫之一，对植物生长发育的各个阶段都有不利的影响，特别是高温对农作物产量的影响尤为严重。因此研究植物对高温逆境的反应机制具有重要的理论及实际意义。为了研究植物对热胁迫的反应机制，我们建立了由热诱导基因HSP18.2启动子驱动的荧光素酶（LUC）作为报告基因的转基因材料，通过EMS诱变该材料后筛选得到突变体HL761。与野生型相比，该突变体在热胁迫下，报告基因LUC的表达被超激活，突变体对热胁迫的耐受性显著降低。图位克隆以及生物信息学分析显示发生突变的基因（暂时命名为SRP1）编码一个与剪接相关的蛋白。我们推测SRP1可能通过调节下游靶基因的剪接从而调节拟南芥的耐热性。本项目拟通过对SRP1基因的表达特征，其相互作用蛋白的鉴定，以及SRP1突变引起其靶基因特别是热相关基因的转录水平及剪接方式的改变等进行研究，从而阐明SRP1在植物对热胁迫的反应中的功能。

为了研究植物对热胁迫反应的机制，前期我们通过EMS诱变筛选获得一个突变体HL761，经图位克隆及生物信息分析鉴定突变的基因为剪接相关蛋白SRP1（SPLICING RELATED PROTEIN 1）。该突变使得SRP1蛋白第255个氨基酸由甘氨酸Gly变成谷氨酸Glu。而突变体HL761显示对热胁迫敏感的表型，其对热胁迫的耐受性比野生型显著降低。本项目目的在于揭示HL761表型后面的分子机制，探究SRP1基因在植物对热反应中的功能。通过项目的实施，我们发现：在突变体HL761中报告基因荧光素酶LUC在热激时表达显著上升，这与LUC的蛋白活性相一致；与HL761点突变表型一样，SRP1的T-DNA插入突变体也呈现对热胁迫敏感的表型；SRP1在植物体内为组成型表达，在根、茎、叶片、花和果荚中都有表达，并且在繁殖器官中表达量要高，GUS报告基因显示SRP1主要在植物维管组织中表达；亚细胞定位显示SRP1蛋白位于细胞核内；通过RNAseq，我们检测了野生型以及HL761突变体在未热激、热激10分钟、热激60分钟的基因表达变化发现，热激60分钟处理可引起植物体内基因表达的急剧变化，60分钟时HL761相比于野生型下调的基因大部分为热激诱导表达的基因，而HL761中上调的基因大部分被热胁迫所抑制；qPCR检测HSFA1D、HSFA7A与HSFA7B等热激转录因子，HSP18.2、HSP23.5、HSP60等热激蛋白以及一些热反应相关基因在HL761中的表达相比野生型明显要低；同时SRP1突变还导致HSFA2、HSFA7A、HSFA7B等热激转录因子和一些热反应相关基因的剪接发生改变；这些结果说明SRP1既可通过调节热激转录因子HSFs与热激蛋白等热反应相关基因的转录水平，又可影响这些基因mRNA的剪接，从而调节植物对热胁迫的反应。