柳枝稷调控胱硫醚-γ-合成酶影响木质素合成的分子机制研究

Switchgrass has attractive features as feedstocks and the second generation of bioenergy. The lignin in cell walls has been considered as a hindrance in effective bioconversion of lignocellulosic biomass and digestion of feedstocks. The C1 metabolic intermediates, S-adenosyl-L-methionine (SAM), can supply methyl residues for lignin methyltransferase reactions. Thereby, it is meaningful to explore the regulation mechanisms controlling lignin biosynthesis through C1 metabolism. In our previous work, we have been verified changing the mRNA level of CYSTATHIONINE-γ-SYNTHASE, the first key enzyme of methionine (Met) synthesis, could significantly effect the accumulation of lignin monomers. In this project, we attempt to explore the transcription factors of CGS by promoter prediction, in vitro validation and interaction protein of CGS by yeast two hybridation strategy. And then, we will validate their influence on lignin biosynthesis by genetic transformation in switchgrass. Finally, we will reveal the molecular mechanism of effecting the CGS homeostasis, which ultimately influence the lignin biosynthesis. Our project supplied a novel resource for cell wall bioengineering for bioenergy plants and feedstocks.

柳枝稷既是重要的牧草作物也是第二大能源植物，但是细胞壁中的木质素是制约生物质能源有效转化和牧草饲料消化的主要因素之一。植物一碳代谢中间物S-腺苷甲硫氨酸（SAM）能够为木质素单体甲基化反应提供活性供体，然而一碳代谢对木质素的调控机制尚不清楚，因此研究其调控机制能够拓宽人们对木质素代谢机制的认识。申请人先前研究发现改变了柳枝稷一碳代谢第一个关键酶胱硫醚-γ-合成酶（CGS）的表达水平能够显著影响木质素的合成。因此本项目拟通过启动子生物信息学分析、转录因子体外功能研究和酵母双杂交文库筛选等获得柳枝稷调控CGS的因子，并进一步通过柳枝稷遗传转化研究上述因子的体内功能，最终解析柳枝稷调控CGS水平影响木质素合成的分子机制。本项目所获得的基因能够作为分子育种的靶标用于创制高细胞壁品质的能源植物和牧草作物种质新资源。

本项目系统分析了柳枝稷胱硫醚-γ-合成酶基因CGS对木质素单体合成的影响，并通过酵母cDNA文库筛选获得了一个调控PvCGS基因的转录调控因子PvMYB4L。通过EMSA、转录激活试验验证了PvMYB4L转录因子结合PvCGS基因启动子区的AC基序，进而激活PvCGS基因的表达。通过对PvCGS基因过量表达和抑制表达，获得阳性转基因株系，结果表明PvCGS基因通过影响柳枝稷体内S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和S-腺苷高半胱氨酸（SAH）的比例，进而影响木质素单体合成。为了进一步验证SAM和SAH的含量与比值如何影响木质素单体，尤其是甲基化木质素单体（G型和S型）的含量，我们体外重组了木质素单体甲基化修饰的咖啡酸-O-甲基转移酶COMT和咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶CCoAOMT，并通过研究SAM和SAH的不同剂量分析了二者对COMT和CCoAOMT活性的影响，结果表明，随着SAH含量的增加，CCoAOMT和COMT的活性均有不同程度的降低，并且SAM和SAH的比值表现出与CCoAOMT和COMT活性更好的相关性。通过本项目的研究，系统解析了柳枝稷CGS基因对木质素单体甲基化修饰的影响机制，从理论上充实了植物一碳代谢途径对木质素合成的调控机制，为今后能源草细胞壁工程提供了新的靶标。