青海省藏羊住肉孢子虫种类鉴定及血清学诊断方法的建立

Sarcocystis as a zoonotic parasite, responsible of a considerable impact on meat food safety problem. The accurate diagnosis method of this disease is very limited, which seriously affect the economic development of animal husbandry in Qinghai province. Conventional trichinoscopy method is used to study the morphological observation, species identification and evaluate the homology analysis of the Sarcocystis in Qinghai Tibetan sheep.The epidemiologic survey and cases studies on sarcocystis in Qinghai Tibetan sheep to diagnose sarcocystis in Qinghai at molecular biology level has been conducted in order to detect more accurately that infection . Through chicken embryo virus infection experiment, clinical experimental by insect attack to determine the toxicity test for harm by sarcocystis evaluation ; sarcocystis of the Tibetan sheep culture experiment in vivo and in vitro, the application of transcriptional and proteomic sequencing tools to screen out the dominant surface antigen gene for gene expression and check out the function to establish a rapid, effective and high specific serological diagnosis method; a series of programs on sarcocystis of Tibetan sheep supported by the government in field of ecological and domestics animal husbandry, which would have high significance by improving the health development of the animal husbandry economy of Qinghai province, increase the control ability of Tibetan sheep parasitic disease, change the situation of livestock spring weak death and increase the income of herdsman.

住肉孢子虫作为一种人畜共患的寄生虫，对于肉食品的安全问题已经产生了相当大的影响，且该病生前诊断方法特异性较差，阻碍着青海省畜牧业经济的发展。本研究项目采用常规的压片镜检法检查藏羊住肉孢子虫，并进行虫体形态观察、种类鉴定、同源性分析，以了解和掌握青海省藏羊住肉孢子虫的感染和流行情况、虫体的种类，明确藏羊住肉孢子虫在分子生物学层面上的特性；通过鸡胚染毒实验、实验动物攻虫实验进行毒性试验，明确藏羊住肉孢子虫的危害作用；对藏羊住肉孢子虫进行体内外培养，应用转录组和蛋白组测序，筛选出优势的表面抗原基因，并对其基因进行表达、功能验证，建立一种快速有效、特异性较强的血清学诊断方法。项目的研究内容及研究成果在提倡进行生态畜牧业、绿色畜牧业前景下，对于提高青海省藏羊住肉孢子虫病的诊断技术及防控能力，改变牛羊因春乏死亡的现状，加快青海省畜牧业经济的快速、健康发展，提高农牧民的收入均将产生深远的意义。

住肉孢子虫是一种的人畜共患的寄生性原虫，宿主动物感染后可引起贫血、消瘦、乳产量下降、流产，甚至死亡。藏羊是分布在青藏高原地区的重要物种，藏羊养殖业是青海省畜牧业的支柱产业，也是牧民的主要收入来源，而住肉孢子虫感染的肉食品安全问题已经产生了很大的影响，也严重阻碍着青海省畜牧业经济的发展。本项目于2016年9月下达，编号31660698。主要研究内容和结果为：（1）青海省7个县238份膈肌、711份食道肌、221份心肌样品进行了感染率、感染强度调查，结果表明青海藏羊三种肌肉组织中虫体感染率和感染强度均较高，心肌中虫体的感染率和感染强度最高。（2）藏羊膈肌、食道、心肌住肉孢子虫形态学观察鉴定及核糖体RNA测序分析比对，最终确定藏羊膈肌、心肌检获虫体为囊状住肉孢子虫，食道肌检获虫体为巨型住肉孢子虫；牦牛心肌中检获虫体为枯氏住肉孢子虫。（3）经小鼠和SPF鸡胚攻毒试验确定了虫体的致病性。（4）利用Vero细胞分别建立了巨型住肉孢子虫、枯氏住肉孢子虫的体外培养方法。对枯氏住肉孢子虫侵入后对细胞EGFR信号通路的作用进行了研究，阐明了虫体侵入对宿主细胞EGFR信号通路的调控和该通路在虫体侵入过程中的作用。（5）对藏羊巨型住肉孢子虫致密颗粒蛋白14（GRA14）进行克隆表达，建立了间接ELISA血清学诊断方法。综上，研究结果为提高青海藏羊住肉孢子虫病的诊断技术及防控能力提供了科学依据，对于改变牛羊因春乏死亡的现状，加快青海藏羊养殖业的快速、健康发展，提高农牧民的收入均将产生深远的意义。