转录因子SRF调控胃癌转移的作用及机制分析

转移是胃癌患者死亡的主要原因，转录因子调控是其关键，转录因子活性检测对研究胃癌转移更有意义。本实验室前期将人GC9811及其经裸鼠腹膜种植后获得的高转移潜能GC9811-P两株胃癌细胞系用转录因子活性谱芯片进行两次高通量筛选，得到17个活性差异的转录因子。经初筛选择潜力较大的转录因子SRF多为研究对象，用免疫组化及实时定量PCR方法在临床组织中验证，结果显示与无转移的胃癌组织相比，有转移的胃癌组织中SRF阳性率明显增高,下调SRF表达后胃癌细胞转移能力下降。本课题拟在前期研究基础上，通过转染、EMSA、实时定量PCR等方法，在体内、外及临床标本水平多途径验证差异转录因子SRF在胃癌转移中的作用；通过MicroRNA芯片、报告基因及CHIP等实验，探讨SRF通过哪些含SRF结合元件的分子（如已预测的43个MicroRNA分子）调控胃癌转移的转录机制，为胃癌转移研究提供新的预测指标和干预靶点。

我们按照研究计划完成了本项目。采用高通量转录因子活性谱芯片，通过对低转移胃癌细胞系GC9811和高转移胃癌细胞系GC9811-P进行两次差异筛选，选择出SRF为研究对象进行进一步研究。采用免疫组化及Western Blot检测SRF在胃癌原发灶、淋巴结转移灶及远端转移组织中的表达，结果发现与原发灶等组织相比，活化的SRF（p-SRF）主要定位于胃癌转移组织细胞的胞浆和胞核中，以胞核为主；SRF在低转移胃癌组织及细胞中主要为胞浆表达。成功构建了SRF的siRNA载体，转染胃癌高转移细胞系GC9811-P细胞和胃癌SGC7901细胞。结果发现SRF siRNA转染后，GC9811-P细胞和SGC7901对细胞外基质Matrigel的粘附能力下降，其运动、迁移及侵袭能力也显著下降。体内转移实验表明，SRF siRNA能明显抑制GC9811-P及SGC7901细胞的肝脏、肺脏及腹膜转移能力。而采用SRF正义质粒上调胃癌低转移细胞系GC9811及SGC7901细胞系后，两细胞系的侵袭、迁移、粘附能力显著增强。利用MicroRNA芯片，发现miR-199a及miR-7可能是SRF的下游调控分子。在SRF高表达的胃癌转移组织及细胞中，miR-199a-3p和miR-199a-5p也为高表达。SRF siRNA抑制SRF的表达后，GC9811-P细胞中的miR-199a-3p和miR-199a-5p表达显著下调。miR-199a-5p可以促进胃癌细胞的转移，而miR-199a-3p没有显著作用。并且SRF在胃癌细胞细胞核内可以直接结合miR-199a-1和miR-199a-2的启动子区域，进而正向启动miR-199a-1和miR-199a-2的转录，调节miR-199a-3p和miR-199a-5p的表达。而miR-7高转移性胃癌细胞株和肿瘤转移组织中的表达都显著下调。体内外实验发现，miR-7表达升高后，胃癌细胞运动侵袭能力下降；miR-7表达降低后，胃癌细胞运动侵袭能力升高。并且胰岛素样生长因子-1受体（IGF1R）是miR-7的直接作用靶蛋白。使用siRNA沉默IGF1R的表达，miR-7具有抗肿瘤转移潜能，而恢复IGF1R的表达会抑制胃癌细胞中miR-7的功能。miR-7通过靶向作用于IGF1R抑制Snail，进而增加E-钙粘素的表达，部分逆转上皮间质转化（EMT）。