基于时间-空间二维分辨微流混合技术的蛋白质折叠动力学研究

Proteins achieve their biological functions after they fold into their native structures, while misfolding results in diseases. Therefore, solving protein folding problem is not only an academic interest, but also with medical significance. We propose to utilize a microfluidic mixer which can realize both time and spatial resolved Raman spectroscopy to explore protein folding kinetics and investigate related physical problems. The microfluidic mixer is bonded with a surface enhanced Raman scattering (SERS) substrate. The SERS substrate plays a dual role. At first, the substrate greatly enhances Raman scattering and makes it possible to use Raman probe studying protein folding kinetics in a microfluidic mixer. Second, the SERS substrate adsorbs protein molecules when they are flowing through the microfluidic mixer. As a result, all folding events will be fixed in the specific positions on the substrate according to the folding course, including the low populated transient events. Time-resolved SERS data could be collected by scanning the observation channel along the fluid; transient and heterogeneous events which used to be covered by ensemble events could be detected by scanning across the observation channel. Therefore, achieving both time and spatial 2D resolved Raman spectroscopy comes true. This powerful tool will allow us to observe protein folding more comprehensively, access plentiful experimental data and push protein folding theory moving forward.

正确折叠的蛋白质具有生理功能，错误折叠导致疾病的发生。因此，解密蛋白质折叠问题不仅具有学术意义，更具有治疗疾病的重大意义。本项目提出基于SERS基底的微流混合器进行蛋白质折叠动力学研究，实现时-空二维高精度分辨，并对涉及的关键物理问题进行深入研究。SERS基底在微流混合器中起双重作用：1. 放大拉曼信号，使基于微流混合器结合拉曼探针进行蛋白质折叠动力学研究成为可能；2. SERS基底吸附蛋白质，在微流混合器中折叠的不同阶段的蛋白质分子将沿着流动方向被吸附到SERS基底的相应位置，发生在蛋白质折叠过程中小概率的"暂态"事件被"凝固"下来。纵向扫描微流混合器以增强的拉曼光谱为探针进行蛋白质折叠动力学研究；横向扫描，则可俘获被掩盖在ensemble现象下的个体事件和暂态事件，实现时-空二维分辨。应用该技术可以更全面地、多角度地观察蛋白质折叠过程，获得更为丰富的实验数据，推进蛋白质折叠理论的发展。

研究蛋白质构象对认识蛋白质折叠过程及理解错误折叠相关的疾病具有重要意义，而拉曼光谱是一种重要的构象探针。在本项目中，我们提出了一种MAHSO (Mixing Assisted Hot Spots Occupying) 的SERS增强新策略，使得分析物有效进入SERS热点，实现SERS信号的显著增强。基于该思路，我们研制了基于微流混合器的SERS基底制作-检测一体化平台，所用微流混合器为自主设计制作的级联型分裂重组式（C-SAR）微流混合器，以两级级联方式诱导更大的横向运动，显著增强混合效率，实现分析物与银纳米颗粒的均匀混合；吸附有分析物的银纳米颗粒沉积在MAHSO芯片的检测区，分析物恰好落入纳米颗粒的间隙—热点中，产生MAHSO效应，SERS信号增强达数千倍。基于该平台，我们原位研究了一种与遗传性外周神经系统疾病相关的蛋白质PMP22-TM4的野生型（WT）和突变型(G150D)对环境条件改变的响应。实验结果表明， G150D对环境pH值和变性剂浓度的敏感度均高于WT，在不适宜的环境中更易失去天然态构象，进一步的理论分析阐明了突变导致维持蛋白质结构的氢键数量减少，因而对环境变化敏感，易于失去天然态构象，解释了突变蛋白易导致疾病的可能原因。应用MAHSO芯片，我们原位观察到PMP22-TM4的解折叠-再折叠过程，解析了不同构象态蛋白质在银纳米颗粒上的吸附方式。天然态WT以α-螺旋结构 “站立”在银纳米颗粒上，解折叠后失去螺旋结构而“躺”在SERS基底上，再折叠后恢复α-螺旋结构，但是“卧倒”在银纳米颗粒上；天然态G150D则和再折叠后一样以α-螺旋结构“卧倒”在银纳米颗粒上。.通过本项目的实施，我们获得了野生型和突变型PMP22-TM4的构象信息，以及环境与药物对其构象的影响，从分子水平上对遗传性外周神经系统疾病的发生有了一定的理解；研制了基于MAHSO的高灵敏SERS基底制备-检测平台；利用该平台可以原位研究蛋白质对环境变化的响应，观察完整的解折叠-再折叠过程，研究SERS基底对不同构象态蛋白质的吸附作用，并且整个测试都是在水环境中进行，有助于保持蛋白质的活性，对于蛋白质研究具有重要意义。