基于骨-血管重构耦联信号网络探讨刺老苞根皮有效成分群干预骨折愈合的分子机制

经前期临床观察、药效物质基础、体外骨耦联培养体系以及在体骨折愈合模型的研究证实：土家族药-刺老苞根皮有效成分群可增强VEGF、FGF、PDGF及受体等血管相关因子的分泌与表达，诱发骨痂血管生成、改善血液循环，加快胶原合成与钙盐沉积、提高骨痂生物力学性能，促进骨形成，延缓骨吸收。.在上述工作基础上，拟通过构建在体骨痂与局部新生血管动态病理3D模型，观测骨痂结构及周边新生血管形态、分布、走向，从组织解剖学与病理学角度评价刺老苞根皮有效成分群对骨折的愈合修复疗效。同时，建立成骨细胞-破骨细胞-血管内皮细胞体外共培养2D、3D模型，以此深入研究刺老苞根皮有效成分群对骨折愈合修复过程不同细胞间耦联网络关键信号分子表达的调控，从而阐明其对成骨细胞、破骨细胞的趋化、增殖与分化诱导及血管生成的分子作用机制。

首先成功复制SD大鼠胫骨定位打孔骨折模型，经过组织病理学与X-ray观察确定模型制备完成，符合后续试验要求。将动物随机分为对照组、模型组、给药组（刺老苞根皮有效成分群不同剂量组）、中药组（骨伤接骨片）、西药组（左旋多巴胺）。提取药效成分（经生化分析主要为黄酮、皂苷、多糖类化合物），按照人鼠折合计算大鼠不同使用剂量，连续灌胃30天，根据骨伤愈合药效评价标准选择5个观测时间点（即4d、7d、14d、21d、28d）确定为相关试验指标检测点。试验结果如下：（1）刺老苞根皮有效成分群可以升高骨折部位骨小梁体积百分比、骨小梁形成表面百分比、活性生成表面百分比、骨小梁矿化率、骨小梁骨生成率、类骨质平均宽度、骨皮质矿化率，同时降低骨小梁吸收表面百分比，调控骨形成与骨吸收的过程，影响骨痂形态的变化。配合骨痂μCT分析，骨痂的总体积、矿化百分比和平均矿化密度均有所升高，再次确定其对骨痂形态变化的作用。（2）刺老苞根皮有效成分群可以升高骨折部位的力学指标（结构力学与功能力学参数）与骨密度值，增强骨痂的承载力，有利于骨痂的生理功能恢复。（3）刺老苞根皮有效成分群可以升高骨痂新生血管数目、血管容积、容积分数和平均直径，调控新生血管与骨组织的接合、分布与走向，加快骨折部位血管重构，增强血液微循环，促进骨形成。（4）刺老苞根皮有效成分群可以降低机体TC、TG与LDL含量，升高HDL含量，影响脂代谢，协助促进骨折愈合过程。（5）分别完成成骨细胞、破骨细胞、血管内皮细胞体外原代培养，并构建不同细胞间共培养体系。利用HPLC定性定量监控含药血清物质以及稳定性，进行体外试验表明刺老苞根皮有效成分群含药血清对于成骨细胞与血管内皮细胞的增殖与分化有不同程度的促进作用，对破骨细胞有抑制作用，存在一定的量效关系。而不同细胞间的比例不同，可导致相互促分化或抑制现象。（6）利用PCR与western blotting对相关基因、蛋白表达分析表明，刺老苞根皮有效成分群对骨重建与血管形成的部分调控因子有不同程度上调（BMP-2、BMP-4、 BMP-7、Osterix、IGF-1、RANKL、OPG、Runx-2、胶原蛋白 I、VEGF、ET-1、bFGF、ANG、TIMP基因及其蛋白）与下调（ODF、RANK基因及其蛋白）作用，其可能通过两者通路节点基因起到调控骨折愈合过程中骨-血管耦联作用。