共培养技术构建人耳廓形态软骨的体外及大动物体内研究

受种子细胞来源限制，软骨细胞构建的人耳廓形态软骨至今仍无法应用到临床。骨髓基质干细胞(BMSC)可自体大量获得且软骨形成能力强，有望替代软骨细胞用于外耳重建。然而，单独应用BMSC体外构建软骨易收缩变形，且再生软骨不稳定，植入皮下后容易丧失软骨表型，因此目前仍未用于临床。本项目组前期研究中通过软骨细胞共培养模拟软骨微环境成功诱导BMSC形成了软骨，而且进一步证实，小耳病人的残耳软骨细胞同样具有软骨诱导作用，因此有望利用病人残耳软骨细胞与BMSC共培养重建外耳软骨，但这一设想的实际可行性如何目前尚无报道。本项目拟在前期已建立的人耳廓形态软骨构建技术基础上，结合体外构建参数优化及生物反应器，建立体外BMSC与软骨细胞共培养构建精确人耳廓形态软骨的关键技术，并进一步通过大动物体内实验以及病人自体两种细胞共培养体外构建的实际尝试，探讨利用患者自体残耳软骨细胞与BMSC重建外耳临床应用的可行性。

受限于细胞来源不足，组织工程耳廓形态软骨一直未实现临床应用。针对这一问题，本课题首先证实了利用小耳症患者自体骨髓基质干细胞(BMSC)与其废弃的残耳软骨细胞（microtia chondrocyte, MC）共培养构建耳廓形态软骨的可行性。更重要的是，上述研究过程中，我们又意外地发现MC虽然扩增后极易去分化，但其却具备极强的增殖能力（扩增至第8代的MC仍保持着很强的增殖活性）。围绕这一发现，我们又摸索出了能让扩增后去分化的MC重新获得成软骨能力的构建体系（重分化体系），并且进一步利用单例患者来源的MC在体外成功构建出了正常大小的人耳廓形态软骨。然而，在大动物体内，用于辅助维持形态的内支撑与机体接触后极易引发异物反应，最终导致体外构建产物无法形成软骨。为克服这一问题，我们又开发出了形态精确可控并且能被聚羟基乙酸/聚乳酸（PGA/PLA）完全包裹的聚乙内酯（PCL）内核支架，大大增加了体外构建产物的力学性能，规避了钛内支撑的应用，不仅简化了手术流程（无需为取出内支撑而再行手术），而且能有效克服免疫反应。目前，我们已初步在兔体内构建出了耳廓形态软骨。综上所述，本课题证实了MC/BMSC共培养构建耳廓形态软骨的可行性，在上述过程中，又探索出了MC重分化体系并因此获得了大量可稳定成软骨的种子细胞，从而基本解决了耳廓形态软骨构建用种子细胞来源问题；在上述基础上，又通过PCL内核克服了内支撑引发的异物反应，最终，初步在具有一定免疫功能的动物体内构建出了耳廓形态软骨。该研究对组织工程耳廓以及相关技术进入临床具有推动作用。