核黄素转运基因变异与新疆哈、维、汉三民族食管癌发病相关性研究

Xinjiang is one of the high incidence area of esophageal cancer, the prevalence and mortality of Kazakh people has been very high and beyond the average level of other nations. It has been confirmed riboflavin deficiency is an important risk factor for esophageal cancer, riboflavin supplement can significantly reduce the risk, but the effect of dietary supplements of riboflavin intervention showed obvious individual differences,showed that an interaction of environmental and genetic factors in occurrence of esophageal cancer. In our previous esophageal cancer genome-wide association study found that riboflavin transporter gene (C20orf54) is one of susceptibility genes, but only indirectly recognized the genetic changes may be the Key target on interaction of environmental and genetic factors of esophageal cancer. For the purpose of further research the regulation mechanism of C20orf54 gene on riboflavin metabolism in esophageal cancer tumor tissues.In this study, we will collect Paraffin-embedded and/or fresh tissue specimens of Kazakh, Uighur and Han patients with esophageal cancer and precancerous disease, analyze the C20orf54 gene mutation and expression by Mass ARRAY, PCR-RFLP and immunohistochemical methods to find the collelations between esophageal cancer and C20orf54 gene expression regulation; Animal oncogenic models been used to study the function of C20orf54 on transit and exploit of raboflavin, and prove the C20orf54 gene variation is the main reason that affect the individual differences in dietary supplementation with riboflavin intervention effects..In order to further understanding the molecular mechanism of interaction of environmental and genetic factors in occurrence and ethnic differences of esophageal cancer.The result of this study can also provide experimental basis for specific new target on high risk group screening and individualized prevention of esophageal cancer.

新疆是食管癌集中高发区，以哈萨克族发病率最高。核黄素缺乏是食管癌主要危险因素，但膳食补充核黄素干预效果存在个体差异。提示环境和遗传因素在食管癌发生中存在交互作用。我们在前期GWAS研究中发现：核黄素转运基因（C20orf54）是食管癌易感基因，但只能间接认识该基因可能是食管癌环境与遗传因素交互作用的关键靶点。为深入了解C20orf54对核黄素调控机制，本项目拟采用Mass ARRAY，PCR-RFLP及免疫组化等方法，对新疆哈、维、汉三民族食管癌和癌旁正常组织C20orf54基因变异及表达水平分析，研究食管癌发生与C20orf54表达调控关系；并通过动物致瘤模型研究C20orf54基因对核黄素转运和利用作用机制。以此进一步认识环境与遗传因素在食管癌发病和种族差异中交互作用分子机制，为食管癌的高危人群筛查和个体化预防的特异性新靶点提供实验依据

新疆是我国食管癌集中高发区，以哈萨克族发病率最高。核黄素缺乏是食管癌主要危险因素，但膳食补充核黄素干预效果存在个体差异。在前期中我们发现核黄素转运基因C20orf54是食管癌易感基因，且该基因在食管癌组织中较正常组织显著低表达，但其基因变异情况及作用机制不明。本项目通过采用免疫组化、RT-PCR、Mass ARRAY、PCR-RFLP等方法，开展了三个方面研究：1）哈、维、汉三民族食管癌患者及健康人群体内核黄素水平差异分析；2）食管癌及癌旁正常组织C20orf54蛋白及mRNA表达水平差异研究；3）C20orf54基因启动子区域异常甲基化及单核苷酸多态性检测分析。在此基础上，基于Cas-9技术开展裸鼠成瘤实验验证核黄素转运基因对核黄素影响机制。结果发现：1）食管癌组织中C20orf54基因mRNA与蛋白表达与水平显著低于癌旁正常组织，C20orf54蛋白表达与不良预后相关；2）食管癌患者外周血核黄素水平显著低于正常人群，且与C20orf54蛋白表达水平呈正相关；3）C20orf54基因在启动子区域出现异常甲基化，单点甲基化率分析显示，在C20orf54基因12CpG位点中，5个CpG位点（CpG_2，CpG_3，CpG_4，CpG_7，CpG_10）在食管癌组织及癌旁正常组织之间具有“单点”差异，其差异均有统计学意义（P＜0.05），在目的基因片段甲基化分析发现癌组织甲基化水平显著高于癌旁正常组织，且甲基化水平变化与蛋白质表达变化呈负相关（P＜0.05），提示异常甲基化可能是蛋白表达下调继而影响核黄素代谢的重要分子机制；4） C20orf54基因rs13042395位点和rs910857位点基因型及等位基因在食管癌和对照组分布差异有统计学意义（P＜0.05）。但各基因型与食管癌患病风险没有相关性（P＞0.05），相对A等位基因，G等位基因患食管癌风险增高，具有统计学意义（P＜0.05），提示G等位基因可能为食管癌危险因素；5）核黄素转运基因敲除后肿瘤细胞增殖抑制，且模式动物成瘤能力较对照组差。研究结果不仅是新疆哈萨克族食管癌病因学研究提供必要补充，而且为食管癌的高危人群筛查和个体化预防的特异性新靶点提供实验依据。