酵母prion蛋白Ure2的寡聚及构象变化的单分子水平研究

The phenomenon of amyloid fibril formation is closely related to mammalian neurodegenerative disease. It has been reported that the protein oligomers formed early during the process of amyloid fibril formation are the pathogenic species. However, the mechanism of the amyloid protein oligomerization process is still an open question. Study of the mechanism of oligomerization using traditional ensemble techniques is challenging, due to the metastable, transient, and heterogenous nature of the oligomers. In this project, using the yeast prion protein Ure2 as an amyloid model, we plan to study the kinetics of Ure2 oligomerization and structural reorganization within the oligomers using single molecule FRET. We also plan to apply the FRET-FCS technique to analyse the size of Ure2 oligomers and how this changes during the fibril formation process. Finally, we will investigate the conformational change and interdomain interaction within the Ure2 monomers during oligomerization by using a combination of single molecule FRET and single molecule polarization. This research will contribute to understanding of the mechanism of protein oligomerization, and will provide new clues to drug development for neurodegenerative disease.

蛋白质的淀粉样纤维化与哺乳动物神经退行性疾病的发生密切相关，研究表明蛋白在淀粉样纤维化早期所形成的寡聚体是致病组分，而淀粉样蛋白的寡聚化机制目前尚无定论。由于寡聚体具有不稳定、瞬态性、不均一性等特点，使得系综水平的技术手段在淀粉样蛋白寡聚化机制的研究中有局限性。本项目拟以酵母Ure2作为淀粉样蛋白研究模型，应用单分子荧光共振能量传递，研究Ure2寡聚化动力学，以及寡聚体组装形式变化；应用荧光共振能量传递结合荧光相关光谱技术，研究Ure2寡聚体的大小及其在纤维化过程中的变化；应用单分子荧光共振能量传递结合单分子荧光偏振，研究Ure2在寡聚化过程中，分子内部的构象变化机制及结构域之间相互作用。本项目的研究成果将有助于深入理解淀粉样蛋白的寡聚机制，为开发治疗神经退行性疾病的药物提供新线索。

蛋白质的淀粉样纤维化与哺乳动物神经退行性疾病的发生密切相关，研究表明蛋白在淀粉样纤维化早期所形成的寡聚体是致病组分，而淀粉样蛋白的寡聚化机制目前尚无定论。由于寡聚体具有不稳定、瞬态性、不均一性等特点，使得系综水平的技术手段在淀粉样蛋白寡聚化机制的研究中有局限性。本项目以酵母prion蛋白Ure2作为淀粉样蛋白研究模型，应用单分子荧光技术，从分子内和分子间两个方面详细阐释Ure2从天然态向纤维转化过程中的构象变化及寡聚化机制。我们利用单分子FRET技术，发现Ure2 N端prion结构域与C端结构域存在弱相互作用，这种作用的破坏会促使Ure2纤维化的发生。我们探测到Ure2纤维化过程中，寡聚体的生成和消耗的过程，揭示了寡聚体从疏松构象向紧密构象的转变，而后者具有β-sheet结构能够延伸形成纤维。采用动力学建模分析，建立了寡聚-转化的多步动力学模型，对单分子寡聚化数据与系综ThT纤维化数据进行全局拟合，定量阐释了Ure2寡聚体的生成、消耗、转化成核的动力学过程。结果表明，Ure2遵循以纤维断裂为主导的纤维核心生成机制，有别于致病淀粉样纤维以表面催化的二级成核为主导的机制。本项目研究将淀粉样蛋白的寡聚化与纤维化建立起定量联系，为阐释纤维与可溶寡聚体之间的时间和因果关系建立了理论框架，并为功能性淀粉样蛋白与疾病相关淀粉样纤维的细胞毒性差别提出了合理解释。本项目研究建立的单分子结合动力学分析的方法，还可应用于外源分子加速或抑制淀粉样纤维化的微观机制的研究，定量阐明外源因子对于寡聚体生成、累积、以及消耗的影响，为针对神经退行性疾病相关的药物设计和疾病防治提供理论支持和新线索。