电针对脑缺血再灌的Bax基因敲除小鼠的JNK线粒体通路的调控作用

During the cerebral ischemia-reperfusion injury, the Bax gene in the JNK/MAPK signaling pathway, as a major mediator in mitochondrial pathway, plays an important role in inducing the apoptosis of neuron. Previous studies suggetted that electroacupuncture might increase the expression of Bcl-2, reduce the expression of Bax and inhibit the apoptosis of hippocampal and cerebral cortex neurons in mice with cerebral I/R injury. In our study, after the Bax-knockout mice with cerebral I/R injury treated by electroacupuncture, the apoptosis of hippocampal and cerebral cortex neurons will be evaluated by terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling(TUNEL), immunohistochemical technology of neuron-specific enolase (NSE) and Flow cytometry（FCM）; the level of AIF in hippocampal and cerebral cortex neurons will be determined by immunohistochemical technology; the mitochondrial morphology and the function of mitochondria will also be evaluated by light and electron microscopy as well as Laser scanning confocal microscope with fluorescence molecular probe techniques; the expression of Bcl-2 and Bax in hippocampus and cerebral cortex will be tested by RT-PCR and western blot. Thus, the mechanism of electroacupuncture to mediate the JNK signal transduction in mitochondrial pathway and the mechanism of electro-acupuncture treatment may be revealed.

脑缺血再灌注（I/R）损伤过程中，JNK/MAPK信号通路中的Bax基因是线粒体途径的主要介导者，在诱导神经细胞凋亡过程中起重要作用。前期研究发现电针可上调Bcl-2表达，下调Bax表达，抑制脑I/R小鼠皮层和海马细胞凋亡。本研究拟从脑组织、脑功能、脑线粒体形态和功能等多个层面，通过电针刺激脑I/R损伤后的Bax基因敲除小鼠，采用原位细胞凋亡检测方法、神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组化以及流式细胞术（FCM）定量检测大脑皮层与海马细胞的凋亡情况，采用免疫组化方法检测皮层与海马神经元细胞AIF水平，光镜和电镜观察线粒体的形态结构，激光共聚焦显微镜结合荧光分子探针技术检测脑线粒体Ca2+以及线粒体代谢功能，同时采用RT-PCR和western blot检测皮层与海马组织中Bcl-2和Bax的表达，研究I/R损伤诱导脑神经元细胞凋亡的JNK信号转导线粒体通路机制，以及电针组穴的调控作用。

项目研究目标已经按照执行计划完成。建立了Bax 基因敲除小鼠模型。研究复制脑I/R 损伤模型，并评价模型的神经功能、HE 病理、核磁影像状况，通过神经功能评价、HE 病理、核磁影响发现模型小鼠出现明显的神经功能缺失，神经细胞可见损失和变形，大脑水肿现象明显，血管走形模糊并具有明显狭窄。由此，确定了模型的成功状态。通过神经功能评价、HE 病理、TUNEL检测和流式细胞术（FCM）发现电针可有效改善脑缺血再灌注小鼠神经功能评分，减轻神经细胞丢失、变形和减轻细胞活性凋亡率。流式细胞术检测细胞质活化JNK，发现电针可以抑制JNK 的活化。免疫组化检测发现电针可以抑制模型小鼠海马、皮层AIF和NSE的释放。运用Western blot 技术检测Bcl-2 与Bax，发现电针可以上调海马和皮层Bcl-2和下调Bax的表达，并能够抑制Caspase-3表达。此外，发现电针可降低线粒体SOD活性抑制率，并能够抑制脑缺血再灌注小鼠皮层Bax mRNA的表达。.研究从JNK 信号转导线粒体通路的不同环节--I/R 模型、I/R 特征、JNK 活化、Bcl-2 与Bax 平衡、Caspase-3的释放、细胞凋亡结果的多个层次，探讨电针调控脑I/R 损伤诱导脑神经元细胞凋亡的JNK 信号线粒体通路机制。发现电针是通过JNK 信号转导线粒体通路的不同环节，抑制细胞质JNK 活化，上调Bcl-2 表达，下调Bax 表达，抑制AIF和Caspase-3的释放，从而抑制脑神经元细胞凋亡。.本项目研究发现，单次电针针刺脑缺血再灌注急性期小鼠的百会穴、膈俞穴、肾俞穴，就能够明显减少脑细胞的凋亡，改善脑缺血再灌注小鼠神经功能评分。并揭示了一部分电针针刺脑缺血再灌注急性期小鼠抑制神经细胞凋亡的机制，为电针介入脑缺血性疾病急性期的临床治疗提供了实验依据。