ANXA2在DDR2介导MMPs过分泌的分子机制及其在RA关节软骨破坏中的功能研究

Rheumatoid arthritis (RA) is one kind of autoimmune disease which is characterized by disabling joint injury and it seriously threatens the public health. The main reason of RA associated articular cartilage destruction is related to the proliferation and invasion of synovial cells and the MMPs secretion. Literature and previous research work shows that the type II collagen-DDR2-MMPs loop plays an important role in RA associated articular cartilage damage. However, a specific molecular mechanism that involve in DDR2-mediated MMPs secretion remains unclear. Recently, we used the immunoprecipitation and 2D gel electrophoresis technology to screen the DDR2 interaction proteins. And we hypothesized that Annexin A2 might act as a critical molecular in the regulation of DDR2-MMPs pathway.Based on the previous work, this subject intends to do further research to find out the molecular mechanism that activated-DDR2 regulates Annexin A2. Then, we will reveal the details that Annexin A2 regulate the over-secretion of MMPs. Furthermore, we plan to clarify the function of Annexin A2 in the proliferation and invasion of synovial cells and destruction of articular cartilage. These studies will not only push our knowledge of RA associated articular cartilage destruction further, but also provide some effective drug targets for RA prevention. Therefore, this study is very valuable both in the theoretical and clinical significance.

类风湿性关节炎（RA）是一种以致残性关节病变为主的慢性自身免疫性疾病，滑膜细胞过度增生、侵袭及分泌的基质金属蛋白酶（MMP）是造成RA关节软骨破坏的主要原因。我们课题组前期通过实验证实，Ⅱ型胶原可以活化盘状结构域受体-2（DDR2），DDR2的活化可介导RAFLS细胞MMP的过分泌，并最终促使FLS增殖、侵袭能力增强，软骨损伤加重。但目前DDR2-MMP通路中的关键分子和调节机制尚不明确。ANXA2是我们利用免疫沉淀结合双向电泳技术，筛选获得的DDR2相互作用分子，在DDR2-MMP通路中可能扮演关键分子的角色。本课题拟在前期工作基础上，以DDR2的相互作用分子ANXA2的功能研究为突破口，系统的研究DDR2对ANXA2的调控机制，并揭示ANXA2在DDR2介导MMP过分泌中的作用及其在滑膜细胞增殖、侵袭和关节软骨破坏中的功能，既可拓展对RA软骨破坏机制的认识，又能发现潜在的药物靶标。

类风湿性关节炎（RA）是一种以致残性关节病变为主的慢性自身免疫性疾病，滑膜细胞过度增生、侵袭及分泌的基质金属蛋白酶（MMP）是造成RA关节软骨破坏的主要原因。我们课题组前期通过实验证实，Ⅱ型胶原可以活化盘状结构域受体-2（DDR2），DDR2的活化可介导RAFLS细胞MMP的过分泌，并最终促使FLS增殖、侵袭能力增强，软骨损伤加重。但目前DDR2-MMP通路中的关键分子和调节机制尚不明确。ANXA2是我们利用免疫沉淀结合双向电泳技术，筛选获得的DDR2相互作用分子，在DDR2-MMP通路中可能扮演关键分子的角色。为此，我们在前期研究结果的基础上，进行了系列研究，获得了如下结果：1、在HEK293T细胞中通过免疫共沉淀的方法确认了DDR2和ANXA2的相互结合关系，并且证实了ANXA2只能与DDR2的活化形式结合；2、激光共聚焦实验在RA FLS细胞中明确了DDR2与ANXA2存在共定位关系；3、免疫沉淀后磷酸化水平检测显示，在RA FLS细胞中，胶原活化DDR2后，对ANXA2的表达水平影响不大，而ANXA2酪氨酸磷酸化修饰显著增强；4、qPCR实验显示ANXA2的磷酸化修饰能够促进MMP9和MMP13的转录，Western-blot和明胶酶谱实验进一步证实诱导FLS细胞中ANXA2的磷酸化能够上调MMP13的蛋白水平和分泌更多活化的MMP9；5、双荧光素酶报告基因检测显示ANXA2的磷酸化修饰能够显著提高MMP9和MMP13的启动子转录活性；6、Transwell小室侵袭实验中发现ANXA能够促进RA FLSs细胞的侵袭；7、细胞划痕实验则显示ANXA2酪氨酸磷酸化水平的增强能够促进RA FLS细胞的迁移；8、动物实验显示，DDR2缺失小鼠对RA软骨破坏及关节滑膜炎有抵抗作用，Annexin A2干涉病毒局部下调CIA大鼠膝关节和踝关节滑膜族中的Annexin A2后，能够显著缓解关节损伤；9、扩大样本例数后，Real-time PCR和Western-blot实验提示 RA滑膜组织中Annexin A2的表达水平和酪氨酸磷酸化水平均高于OA的滑膜组织。本研究中我们首次证实了ANXA2作为DDR2的相互作用分子在介导DDR2过分泌MMPs及促进RA FLS细胞侵袭和软骨破坏过程中发挥重要作用。该研究结果完善和补充了DDR2-MMPs通路中关键环节和关键分子，为进一