DAZ家族基因在男性无精不育病症中的分子机制研究

Deleted in Azoospermia (DAZ) gene deletion is one of the most common molecular lesion of infertility, accounting for 10-20% azoospermia (infertile men with no sperm), yet the involved mechanisms and function of DAZ remain unclear. DAZ belongs to a highly conserved RNA binding protein family, composed of three family members (DAZ, DAZL and BOULE). Although the roles of DAZL and BOULE and their functional difference from DAZ has not been elucidated, mouse Dazl and Boule each are critical for spermatogenesis, regulating primordial germ cell development, meiosis and spermatid differentiation. More importantly their requirement for gamete production appears conserved across a large spectrum of animal lineages even insects, suggesting they are also important for human fertility. We propose to screen non-obstructive azoospermia patients in order to uncover any correlation between spermatogenic defects in human testis tissues from non-obstructive azoospermia and protein expression pattern of DAZ, DAZL and BOULE. For the patients with DAZ deletions, we will further determine if changes in DAZL and BOULE expression might be associated with their phenotypic variation. We will also explore molecular mechanism of DAZ proteins by identifying downstream targets of BOULE ribonucleoprotein with RNA immunoprecipitation and deep sequencing (RIP-seq). Furthermore we will determine potential association between BOULE target RNA expression and the expression of DAZ family proteins in the patient tissues. The proposed research will could impact the future diagnosis and treatment of male infertility.

人群中约10-15%的男性无精或少精的不育症是源于分子水平上DAZ基因的缺失，但其机理尚不清楚。人DAZ基因来自高度保守的RNA结合蛋白家族，包括DAZ、DAZL及BOULE。其中，DAZL和BOULE是小鼠精子发生过程中关键基因，调控小鼠原始生殖细胞发育、后期减数分裂以及圆形精子分化等关键步骤。尽管研究提示此家族三个成员在物种间的功能可能具有保守性，但其在人类精子发生中功能的异同有待研究。本项目首先筛查出非阻塞性无精症患者，阐明睾丸生精缺陷和DAZ家族各成员表达之间的相关性；针对DAZ缺陷病人，探讨DAZL和BOULE是否与他们的临床表症波动关联；此外，我们还将通过RNA免疫共沉淀-深度测序方法，揭示BOULE的下游免疫复合物的组分，分析病人中DAZ家族各成员表达和BOULE的靶向mRNA表达之间的关联，从而阐明DAZ家族蛋白与男性不育潜在的分子机制，为临床诊断和治疗提供重要依据。

人群中约10-15%的男性无精或少精的不育症是源于分子水平上DAZ基因的缺失，但其机理尚不清楚。人DAZ基因来自高度保守的RNA结合蛋白家族，包括DAZ、DAZL及BOULE。其中，DAZL和BOULE是小鼠精子发生过程中关键基因，调控小鼠原始生殖细胞发育、后期减数分裂以及圆形精子分化等关键步骤。尽管研究提示此家族三个成员在物种间的功能可能具有保守性，但控制其睾丸特征性表达和功能保守性的机制研究甚少，不同成员在人类精子发生中功能的异同有待研究。本项目对于DAZ家族的作用机制、特征性表达和家族成员间的功能的异同方面都取得了重大进展。首先我们揭示DAZL和BOULE的睾丸特征性表达是受的启动子区域的DNA甲基化调控；睾丸组织中的启动子甲基化低水平与精子发生各阶段的细胞有关，而且我们发现启动子区域的在睾丸和体细胞组织中的甲基化差别是在人、小鼠、猪乃至鸡和鱼中都高度保守，揭示了一种启动子区域特异的高度保守的表观遗传学控制不同物种的同源基因组织特异性表达的机制；更令人欣喜的是，人精子中DAZL和BOULE的启动子区域甲基化异常与男性不育显著相关，提供了DAZ家族的表达异常和表观遗传缺陷参与男性不育的证据和导致特发性男性不育的潜在新病因。其次，我们利用果蝇的精子发生为模型，比较了DAZ、DAZL和BOULE的作用，发现DAZL和BOULE都能够挽救果蝇bol敲除的减数分裂的缺陷，DAZ能够部分挽救，揭示这些成员在减数分裂和精子分化中的重叠但不同的作用。确认BOULE 和DAZL小鼠睾丸发育过程中各自的时间和空间定位，支持Boule在减数分裂和圆形精子的分化中起重要作用。而Dazl可能与Boule在减数分裂中有重叠作用，但在早期精子发生的不同阶段起重要作用；进一步运用紫外交联免疫沉淀结合高通量测序技术我们发现DAZL直接结合精子发生的关键步骤的调控因子，从精原干细胞的自我更新因子Plzf，精原细胞的分化因子Ckit到减数分裂的关键因子Sycp3等。并用条件性敲除Dazl的小鼠进行了验证了Dazl的翻译调控作用。我们的工作从而为临床诊断和治疗DAZ家族缺陷导致的男性不育提供了理论重要依据和应用方向。