平菇子实体分化发育相关非编码小分子RNA的鉴定及功能研究

平菇(Pleurotus ostreatus)，属高等担子菌，是世界上广为栽培的第三大食用菌。平菇的生活史一般由担孢子萌发、单核菌丝体配对、双核菌丝体扭结、原基分化、菇蕾发育和子实体成熟等几个主要阶段组成，其中从菌丝体形成子实体的生理过程是一种十分复杂而又高级的分化发育过程。构建平菇菌丝体和不同分化发育阶段子实体的非编码小分子RNA（non-coding small RNA，sRNA）文库，采用高通量的sRNA-Seq技术深度测序建立平菇菌丝体和子实体sRNA的差异表达谱，结合生物信息学方法，鉴定子实体分化发育相关的sRNA，并预测这些sRNA作用的靶mRNA，同时构建包含sRNA基因的表达载体，通过转化及检测靶基因的表达水平来揭示平菇子实体分化发育相关sRNA的功能，进一步探讨平菇等食用菌子实体分化发育的分子机理，为有效控制食用菌的生长与发育、提高食用菌的产量与质量奠定基础。

平菇，学名糙皮侧耳，是世界上广为栽培的第三大食用菌。本试验采用常规栽培方法，分别获得平菇菌丝体和不同发育阶段的子实体：原基、菇蕾、成熟子实体。提取平菇菌丝体与子实体总RNA并分离sRNA，构建cDNA文库，由华大基因公司采用Solexa技术进行深度测序。测序结果表明，sRNA序列的长度大部分在17-23nt之间，而且具有较强的5′ U偏好性, 经过同JGI公布的平菇基因组，以及课题组做的平菇转录组测序后从头组装的基因组比对，并在已知的sRNA数据库中进行检索，分别获得25、35、40、28个在菌丝体、原基、菇蕾、成熟子实体中表达的新milRNA。构建了部分milRNA的差异表达谱，并对其差异表达水平进行了验证，对其二级结构进行了预测。以pCAMBIA1300质粒作为骨架，以不同长度gpd启动子作为顺式驱动元件，成功构建了含有egfp和hph融合表达的表达载体pCAMBIA-gpdx-egfp-hph，经Southern-blot、Western-blot和荧光定量PCR证实，在平菇中gpd启动子长度为403bp就足以驱动egfp-hph基因的表达，但是gpd启动子长度为795bp时，其驱动效果最佳。实验以pCAMBIA1302质粒作为骨架，成功构建了以795bp gpd启动子作为顺式驱动元件驱动egfp和hph融合表达的中间载体pGEH，并以此对两个靶基因PoMsrA、PoMn-SOD的功能进行了研究。 分别提取注射milRNA-1合成类似物后培养24h、36h、48h的菌丝体RNA，经qRT-PCR检测，其预测的靶基因POH1的表达呈差异表达，说明POH1是milRNA-1潜在的靶基因。选取milRNA-1合适的发夹结构前体序列preMilR-60，构建含有重组质粒pCAMBIA1302-gpd-preMilR-60的表达载体并转入根癌农杆菌，再进一步转化平菇菌丝体，结果表明POH1的表达受到了影响，初步证实preMilR-60是milRNA-1的前体，并进一步说明了POH1是milRNA-1的靶标。该结果为研究平菇子实体分化发育的分子机理奠定了初步的研究基础。