溶藻细菌及其胞外活性物质对米氏凯伦藻的溶藻机制研究

Based on "bacteria for biocontrol of algae" concept, Karenia mikimotoi Hansen which is toxins producing with wide occurrence, high frequency and adverse effects on the environment is regarded as the research object. Algicidal bacteria will be isolated from soil and water in the high incidence bloom areas. In order to explore the algae –lysing substances and lytic mechanism, algae-lytic substances are isolated by separation technology first, then use scanning electron microscope(SEM), transmission electron microscope(TEM) and confocal laser scanning microscope (CLSM) to track algae-lysing process; The chlorophyll fluorescence, active oxygen(ROS) change and algae antioxidant defense reaction are combined to discuss the algicidal mechanism under physiological, biochemical and gene expression levels.

基于“以菌治藻”的生防理念，选择近几年发生频率高、涉及面广、危害严重的产毒藻-米氏凯伦藻为研究对象，分离筛选出高效溶藻细菌。采用物质分离技术分离纯化杀藻菌所产生的杀藻活性物质，研究其作用特点与条件；同时针对藻-菌关系研究的不足、缺陷与难点，以微生物杀藻机理研究为目标，采用扫描、透射电镜、激光扫描共聚焦等显微技术跟踪杀藻过程；结合杀藻活性物质胁迫下藻细胞叶绿素荧光、活性氧ROS变化及藻细胞抗氧化系统和光合系统对藻细胞防御及作用靶点相关基因的表达，从生理生化和基因水平阐释杀藻菌及其杀藻活性物质的作用机制。

结合杀藻验证、电镜形态观察、菌株的分子鉴定及系统发育树分析从福建云霄红树林沉积物中分离筛选出5株高效溶藻细菌菌株，并开展了溶藻机制研究。建立了荧光分光光度法所检测的荧光值和藻细胞个数的关系，用于后期杀藻率测定。溶藻菌株表现出了较好的广谱性，其中菌株以间接方式杀藻，且杀藻菌能够利用杀藻过程中藻的分泌物生长，其发酵液在指数生长期和稳定期前期，均表出很高的杀藻效率。其中菌株U3发酵液具有热不稳定性，应保存于低温偏酸性环境中；而菌株HSY-03，Y35具有较好的光、热和酸碱稳定性。通过扫面电镜（SEM），投射电镜（TEM）和激光扫面共聚焦显微镜（CLSM）进行了杀藻过程的跟踪。溶藻细菌胞外活性物质作用0.5h后藻细胞即能产生过多的ROS，同时藻细胞蛋白质含量降低，抗氧化酶活性变化。诱导藻细胞膜脂过氧化，细胞裂解。伴随出现藻细胞叶绿色a和类胡萝卜素含量降低，光合作用效率降低，与光合作用相关的基因psbA, psbD和与CO2固定相关的基因rbcL表达均出现下调。抑藻活性物质的分离纯化；通过Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离；硅胶柱分离结合杀藻验证进行抑藻活性物质的分离，通过质谱检测分子量；核磁共振成像解析结构，分离鉴定出菌株LY03产几丁质酶用于杀藻，而细菌Y35通过分泌杀藻化合物Deinoxanthin达到控制藻细胞生长。为了加强杀藻活性物质的应用效果，本研究中对杀藻化合物Deinoxanthin理化性质进行探究，并用壳聚糖－海藻酸钠对该杀藻物质进行包埋固定化，完成杀藻制剂的制备，以期为下一步将杀藻化合物应用于藻华的深化理论研究与灾害有效治理奠定基础．