利用ATRP反应制备双孔道快流速生物分离介质及其性能研究

现有多糖类层析介质由于孔道狭小、机械强度低，难以进行蛋白质等生物大分子的规模化快速分离，已成为生物技术发展的限制性因素。刚性且亲水的超大孔合成介质为解决这个问题提供了有效思路，本项目从微乳液两相连续体结构和表面活性剂吸水溶胀形成反胶团过程获得启发，结合常规致孔剂相分离作用，拟开发一种新型、简便、孔结构可控的双孔道（贯穿孔和扩散孔）快流速生物分离介质。计划采用原子转移自由基聚合反应（ATRP）合成带有双键的双亲性两嵌段大分子单体代替油溶性乳化剂，协同小分子不良溶剂致孔，一步实现双孔道聚合物微球的制备和亲水修饰，并探索微球双孔道的形成机理。利用微球表面的羟基将其进一步功能基化，考察介质对不同分子量生物大分子的分离效果，建立微球双孔道比例与蛋白分子量大小对应关系的分离模型，实现蛋白吸附容量和分离速度的最优化，探索其快速分离机理，为双孔道生物分离介质的应用提供实验根据和理论基础。

蛋白质、疫苗等生物大分子的规模化分离制备是降低生物制品成本，保证现代生物技术产业造福人类社会所亟需解决的问题。现有的多糖类层析介质由于孔道狭小、机械强度低，难以进行蛋白质等生物大分子的规模化快速分离，制约着当代生物技术的产业化。本项目首先以原子转移自由基聚合技术合成了分子量和亲油亲水平衡（HLB）值可控的双亲性两嵌段含糖聚合物（AM）。我们对AM的合成条件进行了系统考查，采用激光共聚焦和电导率法探讨了油相中AM吸水溶胀的致孔机理，为超大孔微球的制备提供了理论指导。在此基础上利用AM作为表面活性剂，结合小分子致孔剂，采用表面活性剂反胶团溶胀法制备了一种具有双重孔道分布的超大孔亲水性聚苯乙烯微球。该微球表面具有类似多糖微球的亲水性和生物相容性，骨架为高强度交联聚苯乙烯，并且具有微米级（1-10 μm）超大孔结构，进一步衍生后是一种极具潜力的生物大分子快速分离介质。此外，我们利用超大孔聚苯乙烯微球合成了温敏型分离介质和pH/温度双敏感型分离介质，对三种模型蛋白进行快速分离。温敏型分离介质仅通过改变柱的温度梯度（50 ℃-28 ℃-15 ℃）就能实现对三种亲疏水性质不同的蛋白质的完全分离，当流速达到2167 cm/h时该超大孔生物分离介质在7 min内快速分离混合蛋白，并达到较好的分离效果。pH/温度双敏感型介质通过调节流动相的pH值（pH 7.4-pH 5.6）和温度梯度（65 ℃-26 ℃）分离混合蛋白，同样获得了良好的分离效果，在流速达到2528 cm/h时仍然能够实现三种混合蛋白的有效分离。. 本项目制备的亲水性超大孔聚苯乙烯微球在生物大分子分离领域具有很大的应用潜力，在后续试验中我们将进一步优化制备条件，争取早日实现分离应用。