淋球菌耐头孢曲松相关基因的功能定位及调控研究

我们在国家自然科学基金的资助下，在国际上首次体外人工诱导出稳定的耐头孢曲松淋球菌，并运用抑制性消减杂交（SSH）结合DNA芯片技术发现了多个耐药相关基因及一些功能不明的基因。为准确地研究这些基因在淋球菌耐药机制中的作用和地位，我们拟采用最新的研究基因功能的siHybrid技术对目的基因进行研究，从而在基因调控的水平上阐明淋球菌对头孢曲松耐药的分子机制，并明确这些功能不明基因的确切作用。本研究还同时可验证siHybrid在淋球菌细胞内产生基因沉默作用的可行性，开辟基因治疗新途径，为今后耐头孢曲松淋球菌感染的生物治疗奠定理论基础。.淋球菌极易对各种抗菌药物产生耐药，头孢曲松是目前治疗淋病的首选药物，但全球范围内淋球菌对其敏感性下降的趋势使淋病的治疗面临严峻的挑战。本课题前瞻性地研究淋球菌对第三代头孢菌素耐药的分子机制及基因治疗手段，对我国乃至全球淋病的预防和治疗都将有十分重大的意义。

尽管头孢曲松耐药淋球菌已经在全球多个国家出现，但迄今淋球菌对头孢曲松耐药的分子机制仍未完全阐明。为全面阐明淋球菌对头孢曲松耐药的分子机制，我们运用头孢曲松次抑菌浓度法体外诱导WHO标准株A~E，选择诱导后对头孢曲松耐药的菌株，对已知的与头孢曲松耐药相关的penA、ponA、mtrR、penB、gyrA、parC基因进行PCR扩增及测序，并进一步进行诱导前后耐药菌株的基因组和转录组差异分析。结果D株（MIC 0.016→4.096）转变为稳定的头孢曲松耐药株，出现penA（A501V）突变。对D株进行诱导前后基因组和转录组差异分析，我们再次验证了诱导后D株出现头孢曲松耐药与penA基因突变有关，此外，还发现了多个以往从未有报道的淋球菌中头孢曲松耐药相关基因，包括ABC transporters（利用ATP进行跨膜转运的膜融合蛋白）、FarB（构成FarAB-MtrE外排系统）、ExbB（高浓度诱导耐药相关）、Hfq（RNA结合蛋白）和PilQ（PilQ多聚体形成微孔）的编码基因，其中ABC transporters、FarB、ExbB和Hfq的编码基因表达上调，而PilQ编码基因表达下调。尤为重要的是，具有多向转录后调控活性的Hfq编码基因发生突变并且表达增强，提示了耐药现象的转录后调控机制。此外，诱导后D株的生化代谢率也明显加快。基于上述研究数据，淋球菌对头孢曲松耐药是一个由降低药物亲和力、增加药物外排和减少药物进入细胞内等多种耐药机制共同参与的转录前和转录后调控现象共存的由量变到质变的复杂过程。