蜡样芽胞杆菌群转录调控蛋白PerR和Fur共同调控过氧化氢酶CatB氧化Mn(II)的作用机制

Microorganism mediated manganese oxidation is the main driving force of the formation of manganese oxides on the earth surface. The applicant of this project verified that the heme-containing CatB had a manganese oxidase function in the Bacillus thuringiensis, but the response of manganese and the regulation mechanism of CatB expression in this strain are not clear. The preliminary study of this project found that the transcriptional regulatory proteins PerR and Fur combined with the promoter regions of catB and its upstream cofactor heme synthetase gene hemH2, respectively, and the expression levels of perR and fur changed significantly after the stimulation of manganese, suggesting that PerR and Fur can response to manganese and involve in the regulation of CatB expression and activity. This project will specify the binding regions of shortest DNA motif and the key amino acids of PerR and Fur at firstly, and then construct the perR, fur, hemH2 knockout strains, complemented strains and overexpression strains, respectively. This project will elucidate the molecular mechanism of two transcriptional regulatory proteins co-regulating CatB manganese oxidizing activity by PerR and Fur directly regulating catB and hemH2, and PerR indirectly regulating hemH2 through regulate fur under the addition of manganese. This project aims to reveal a complex manganese oxidase regulation mechanism, providing the theoretical support for the important role of microorganisms in biogeochemical cycling of manganese.

微生物介导的锰氧化是地表锰氧化物形成的主要驱动力。申请人在苏云金芽胞杆菌中证实含血红素的过氧化氢酶CatB具有锰氧化酶的功能，但菌株对锰的响应及CatB的表达调控机制不清楚。本项目前期研究发现，转录调控蛋白PerR和Fur能分别与catB及其上游辅基血红素合成酶基因hemH2的启动子区结合，且锰刺激后perR和fur表达水平显著变化，提示PerR和Fur能响应锰并参与调控CatB的表达和活性。本项目首先明确结合区DNA的最短基序和PerR、Fur关键氨基酸位点，再分别构建perR、fur、hemH2的敲除株、回补株和过表达株，加锰刺激下从PerR与Fur直接调控catB与hemH2，以及PerR通过调节fur间接调控hemH2的途径阐明两个转录调控蛋白共同调控CatB锰氧化活性的分子机制，本项目旨在揭示一种复杂的锰氧化酶调控机制，为微生物在锰的生物地球化学循环中的重要作用提供理论支撑。

微生物介导的锰氧化是地表锰氧化物形成的主要驱动力。申请人在苏云金芽胞杆菌中证实含血红素的过氧化氢酶CatB具有锰氧化酶的功能，但菌株对锰的响应及CatB的表达调控机制不清楚。本项目证实了过氧化氢压力调节蛋白PerR和铁吸收调节蛋白Fur均能直接与catB启动子区结合，Fur还能与hemH2启动子和fur本身的启动子区结合。在Bt 97-27中成功构建了OEperR、OEfur和OEhemH2过表达株，Δfur、ΔhemH2基因敲除株和对应的回补株。考察这些菌株对不同浓度Fe3+、Mn2+、H2O2压力响应下的生长代谢情况。培养基中添加低浓度的铁或锰离子不会影响Bt 97-27、△fur和OEperR菌株的生长，但高浓度则会抑制菌体生长，且5 mM Mn2+下菌株生成的锰氧化物量最高。同时添加适量锰和铁离子时，会随着铁/锰比例的增加显著促进Bt 97-27和OEperR菌株生长，但却明显抑制了菌株形成锰氧化物。不同浓度H2O2胁迫下，OEperR菌株比Bt 97-27对H2O2更敏感，降解H2O2能力更弱，其在含2 mM H2O2的培养基中无法生长。但加入0.5 mM Mn2+即可解除H2O2压力，使菌株恢复生长。锰氧化实验表明，OEperR菌株锰氧化能力显著高于Bt 97-27，而Δfur敲除株锰氧化能力显著低于Bt 97-27。qRT-PCR证明了Bt 97-27菌株中hemH2与catB基因可以共转录，且锰刺激后菌株中perR、fur、hemH2与catB基因的表达水平显著变化。本项目阐明了PerR与Fur分别直接调控catB与hemH2，以及PerR通过调节fur间接调控hemH2的具体途径和调控模式。明确了PerR和Fur共同调控过氧化氢酶CatB氧化Mn(II)的分子机制，揭示一种复杂的锰氧化酶调控机制，为微生物在锰的生物地球化学循环中的重要作用提供理论支撑。