钉螺体内日本血吸虫幼虫的体外长程培养及其发育增殖机制研究

本项目在已建立钉螺胚胎细胞传代与肝脏细胞原代培养方法(No:30470241)、血吸虫童虫与终宿主细胞共培养体系（No:30771876）等基础上，利用多种钉螺培养细胞模拟血吸虫幼虫在中间宿主钉螺体内的生长发育环境，摸索出血吸虫幼虫最佳培养条件，建立一个钉螺宿主细胞与血吸虫幼虫共培养的稳定体系，完成日本血吸虫钉螺体内各期幼虫：毛蚴-母胞蚴-子胞蚴-尾蚴的体外长程连续培养；同时，阐明日本血吸虫幼虫在钉螺体内的无性增殖方式，为研究血吸虫与宿主的相互关系以及血吸虫发育生物学奠定基础；此外，运用比较蛋白质组学方法，研究母胞蚴与子胞蚴或培养母胞蚴与体内母胞蚴的差异蛋白，寻找一个或若干个与日本血吸虫幼虫发育繁殖相关的功能蛋白、关键酶类，以期阐明其生长发育与繁殖机制，为研制有效阻断血吸虫病传播疫苗和新药研制等提供科学依据，具有重要的学术价值与理论意义。

日本血吸虫钉螺期幼虫的体外连续培养及其生长发育机制的研究鲜有报道。本课题利用多种钉螺组织浸出液模拟血吸虫幼虫在中间宿主钉螺体内的生长发育环境，筛选并建立了钉螺头足部组织浸出液与血吸虫幼虫共培养的稳定体系，完成了日本血吸虫钉螺体内幼虫从毛蚴到母胞蚴的体外长程连续培养。同时，运用抑制差减杂交技术，研究钉螺头足部组织浸出液对体外培养的母胞蚴基因表达的影响，筛选出1097个在共培养母胞蚴体内呈上调和下调表达的差异基因。通过斑点杂交技术及序列比对进一步筛选后，分别获得正向差异表达基因31个，正向上调基因主要参与细胞代谢、电子传递链、氧化还原反应和对化学刺激应激等生物学过程；反向差异表达基因20个，主要参与假尿嘧啶核苷合成、RNA加工和核糖体合成等生物学过程。对部分差异基因的RT-PCR初步分析结果显示，编码 NADH-辅酶Q氧化还原酶1（ND1）、细胞色素C氧化酶2（Cox2）的基因在共培养组母胞蚴中显著高表达，而编码先天性角化不良蛋白（DKC1）的基因在对照组母胞蚴中显著高表达。对母胞蚴体内DKC1基因进行进一步克隆表达定位及初步功能研究发现，重组DKC1基因大小为832bp，表达的重组蛋白DKC1分子量为39KDa，SjDKC1主要表达在母胞蚴体壁和胞质中，具有促进日本血吸虫母胞蚴生长发育的功能。血吸虫幼虫体外培养及生长发育基因的研究有助于建立稳定的培养体系，为血吸虫与宿主的相互关系研究、为血吸虫的生长发育与繁殖机制研究等提供技术平台，为研制有效阻断血吸虫病传播疫苗和新药研制等提供科学依据，具有重要的学术价值与理论意义。