基于一种新型粘膜免疫佐剂肺炎链球菌溶血素突变体ΔA146Ply的融合蛋白疫苗诱导Th17免疫应答的作用机制研究

Streptococcus pneumoniae fusion protein DnaJ-ΔA146Ply is a new type of fusion protein vaccine developed by the applicant based on the new type of mucosal immune adjuvant--ΔA146Ply. After immunized mice, it can specifically reduce the number of bacteria in the nasopharynx of mice colonization, and can stimulate the vaccine specific Th17 immune response, but the relevant molecular mechanism is not clear. Therefore, this study is to use the in vitro cell model and mouse model, through flow cytometry, fluorescence quantitative PCR, antibody blocking, ELISA and other methods to explore the receptors and cytokines participate in the DnaJ-ΔA146Ply induced DC cell activation and acquisition Th17 immune response. And then the effect of IL-17A induced by DnaJ-ΔA146Ply fusion protein vaccine on neutrophils and secretory IgA will be studied using IL-17A KO mice. This study can provide a theoretical basis for the further development of the vaccine and provide new research ideas for constructing other protein vaccine based on ΔA146Ply to prevent s.pn and other bacteria.

肺炎链球菌融合蛋白DnaJ-∆A146Ply是申请人前期基于新型粘膜免疫佐剂——ΔA146Ply研发的一种新型的融合蛋白疫苗，粘膜免疫小鼠后，能特异性减少细菌在小鼠鼻咽部的定植，并能激发疫苗特异性的Th17型免疫应答，但是相关分子机制尚不清楚。因此，本研究拟首先利用体外细胞模型和小鼠模型，通过流式细胞术、荧光定量PCR、抗体阻断、ELISA等方法，探讨DnaJ-ΔA146Ply引起DC细胞活化及诱发获得性Th17免疫通路的受体及细胞因子机制，然后利用IL-17A缺陷鼠模型深入研究DnaJ-ΔA146Ply融合蛋白疫苗诱导的特异性IL-17A对中性粒细胞和分泌性IgA的作用。本研究可为该疫苗的进一步研发提供理论依据，并为构建其他基于ΔA146Ply构建s.pn蛋白疫苗乃至其它菌种蛋白疫苗提供新的研究思路。

肺炎链球菌融合蛋白DnaJ-ΔA146Ply是基于新型粘膜免疫佐剂ΔA146Ply研发的一种新型的融合蛋白疫苗。在前期研究中发现，DnaJ-ΔA146Ply粘膜免疫小鼠后，能诱导Th17型免疫应答并减少细菌在小鼠鼻咽部的定植，但相关分子机制尚不清楚。本研究通过体外培养小鼠骨髓树突状细胞（BMDC），经DnaJ-ΔA146Ply处理后，BMDC表面高表达CD40、CD86和MHCⅡ分子，同时细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-23等分泌也增加，提示DnaJ-ΔA146Ply能有效诱导BMDC的表型和功能成熟。TLR4-/-BMDC经DnaJ-ΔA146Ply处理后，其表面分子表达和细胞因子释放均显著低于野生鼠（WT）BMDC，证实DnaJ-ΔA146Ply诱导的BMDC细胞成熟依赖于TLR4。同时，免疫荧光和Western blotting检测结果也显示，DnaJ-ΔA146Ply与TLR4结合，通过MAPK、PI3K-Akt和NF-κB等信号通路激活BMDC细胞。我们采用TLR4-/-小鼠来验证TLR4对DnaJ-ΔA146Ply免疫保护效果的影响。结果发现，TLR4-/-小鼠脾细胞中IL-17A表达显著低于WT鼠；并且DnaJ-△A146Ply免疫TLR4-/-小鼠后，其鼻咽部细菌载量显著高于WT小鼠。提示TLR4缺陷导致DnaJ-ΔA146Ply诱导的Th17细胞免疫减弱，进而影响对肺炎链球菌定植的清除。利用WT鼠和IL-17A-/-小鼠，通过间接ELISA法检测血清、唾液和肺泡灌洗液中抗DnaJ特异性IgA效价，流式细胞术分析肺泡灌洗液的中性粒细胞和巨噬细胞的数量，结果发现IL-17A参与招募中性粒细胞和巨噬细胞至感染发生部位；同时IL-17A不影响血清中特异性IgA的产生，但是参与了血清IgA向粘膜部位转换的过程。本研究结果提示：DnaJ-ΔA146Ply与BMDC细胞表面的TLR4结合，通过MAPK、PI3K-Akt和NF-κB等信号通路激活BMDC细胞，进而诱导Th17型免疫应答，IL-17A通过招募中性粒细胞和巨噬细胞至感染发生部位并促进血清IgA向粘膜部位转换，参与疫苗诱导的对定植的保护作用。本研究内容的完成，进一步深入阐明了DnaJ-ΔA146Ply诱导IL-17A减少肺炎链球菌定植的分子机制，为该疫苗的深入研究提供实验依据。