格式斯氏线虫抑制蛴螬免疫的基因克隆及功能验证

昆虫病原线虫是多种害虫的寄生天敌，其表皮存在抑制昆虫血细胞免疫的蛋白质。利用该类蛋白破坏昆虫防御系统的特性来控制农作物重要害虫，是害虫可持续治理的新思路。本项目拟利用项目依托单位丰富的昆虫病原线虫研究经验和蛋白质研究平台，人工培养格式斯氏线虫，通过制备胶、电洗脱等方法分离纯化线虫表皮蛋白，采用裂解血细胞、抗吞噬、抗包被等方法测定表皮蛋白抑制暗黑鳃金龟幼虫血细胞免疫的生物活性；通过蛋白双向电泳和生物质谱技术获得免疫抑制蛋白的部分肽段序列，通过反向遗传学克隆其编码基因；进而表达该基因，验证表达蛋白抑制蛴螬免疫的功能。本研究旨在自主创新，为研发具有自主知识产权、高效安全的新型生物农药提供基因储备，为进一步研究线虫与寄主昆虫间的相互关系、揭示线虫抑制昆虫免疫的作用机理奠定基础，对确保我国农产品质量安全和农业可持续发展具有重要意义。

昆虫病原线虫是广泛使用的重要生防因子，在侵染寄主的过程中能够抑制或逃避昆虫免疫反应。格氏线虫表皮上的免疫抑制蛋白是保护线虫不受昆虫免疫反应伤害的重要因素。在本研究中，从格氏线虫表皮蛋白粗提物中分离纯化了一个具有抑制昆虫血细胞吞噬作用的蛋白组分，经过双向电泳分离和二级质谱鉴定，获得了免疫抑制蛋白的部分肽段序列，证实其与多个物种的烯醇化酶具有较高同源性。从侵染期线虫克隆到了免疫抑制蛋白的编码基因，该基因由1311bp组成，编码47KDa的蛋白质，具备烯醇化酶家族的各种特征，将其命名为Sg-ENOL。当共注射时，重组Sg-ENOL能显著降低波氏致病杆菌和绿僵菌的LT50，增强对大蜡螟和东亚飞蝗的杀虫活性。免疫电镜分析证明，天然Sg-ENOL定位于线虫表皮。离体实验中，格氏线虫在昆虫源物质诱导下会分泌Sg-ENOL，而无诱导物时不会分泌；活体实验中，格氏线虫进入寄主血腔后开始分泌Sg-ENOL，证明Sg-ENOL与格氏线虫侵染过程相关。本研究首次对昆虫病原线虫表皮蛋白的克隆和特征进行了报道，我们的发现为格氏线虫表皮烯醇化酶在其侵染和寄主免疫抑制中的重要作用提供了强有力证据。本研究初步探索了表皮蛋白的作用机理，也显示了Sg-ENOL在生物防治上的应用潜力。