利用巴西橡胶树乳管系统异源生物合成杜仲橡胶研究

Eucommia ulmoides Oliver rubber is an important industrial raw material for developing special purpose functional materials, however, high production cost has become the main bottleneck of its industrialization. Eucommia ulmoides Oliver and Hevea brasiliensis rubber are trans- and cis-polyisoprene, respectively, the latest research shows that E. ulmoides and H. brasiliensis have a very similar rubber biosynthetic pathway, and EuFPS5 is the decisive gene for controlling the extension of trans-polyisoprene. Therefore, this project will first introduce EuFPS5 into H. brasiliensis by Agrobacterium-mediated transformation system to produce transgenic rubber tree with trans- and cis-polyisoprene, and then knockout HbCPT8 controlling the extension of cis-polyisoprene by CRISPR/Cas9-sgRNA RNP to produce transgenic rubber tree only producing trans-polyisoprene, finally, this project will produce transgenic rubber tree with only trans-polyisoprene and mixture of trans-polyisoprene and cis-polyisoprene. The successful implementation of the project will not only open up the new era of biosynthesis of trans-polyisoprene, but also provide special research materials for major problems in rubber biosynthesis, and provide new ideas for improving the natural rubber industry and promoting industrial upgrading.

杜仲橡胶是发展特殊用途功能材料的重要工业原料，高生产成本成为其产业化的主要瓶颈之一。杜仲橡胶和巴西橡胶分别为反式和顺式聚异戊二烯，仅构象不同，两者具有极为相似生物合成途径，而且，EuFPS5是控制杜仲反式橡胶烃延伸决定基因。基于此，本项目首先利用已有巴西橡胶树遗传转化体系，将EuFPS5导入巴西橡胶树，创制杜仲橡胶和巴西橡胶天然预混的巴西橡胶树，然后，以上述获得的高杜仲橡胶含量的转基因胚为材料，设计敲除巴西橡胶树顺式橡胶烃延伸决定基因HbCPT的双sgRNA，利用已有高效基因枪轰击蛋白技术，将CRISPR/Cas9-sgRNA RNP导入巴西橡胶树，敲除內源HbCPT，创制仅合成杜仲橡胶的巴西橡胶树，最终，获得杜仲橡胶和巴西橡胶天然预混以及仅合成杜仲橡胶的两种巴西橡胶树，探索利用巴西橡胶树乳管系统生产杜仲橡胶。项目成功实施，将开启生物合成杜仲橡胶新时代，为橡胶生物合成研究提供独特研究材料。

杜仲橡胶是发展特殊用途功能材料的重要工业原料，高生产成本成为其产业化的主要瓶颈之一。杜仲橡胶和巴西橡胶分别为反式和顺式聚异戊二烯，仅构象不同，两者具有极为相似生物合成途径，而且，EuFPS5是控制杜仲反式橡胶烃延伸决定基因。本项目克隆了杜仲EuFPS5基因的全长编码区序列，将其构建到橡胶树转化载体上，组成型CaMV 35S启动子下游。利用项目组已有的农杆菌介导橡胶树遗传转化体系，将EuFPS5导入巴西橡胶树，经筛选鉴定获得了多个转基因橡胶树株系。与野生型橡胶树相比，转基因株系叶片略皱，长势无明显差异。半定量PCR结果表明，35S启动子驱动EuFPS5在转基因橡胶树中高水平表达。然而，1H NMR和13C NMR分析表明，一年树龄转基因橡胶树胶乳构象与野生型无明显差异，为顺式-1，4-聚异戊二烯，未检测到杜仲橡胶的反式聚异戊二烯结构。转录组分析发现，转基因橡胶树中橡胶单体分子IPP合成基因表达下调，橡胶起始基团合成基因表达上调。同时，转基因橡胶树稳定期叶片含胶量增加，但橡胶平均分子量略低于野生型，且分子量分布变宽。生物信息学分析预测EuFPS5是一个亲水性胞质蛋白，不存在膜定位信号和跨膜结构。推断杜仲中，EuFPS5通过与膜定位因子互作，结合到橡胶粒子上发挥长链反式聚异戊二烯合成的功能；然而在橡胶树中异源表达的EuFPS5未能定位到橡胶粒子膜上，不能催化合成疏水的长链聚异戊二烯分子。同时，胞质中的EuFPS5发挥与橡胶树同源蛋白HbFPS相同的FPP合酶功能，催化合成亲水性的FPP起始基团。FPP含量增加起始合成了更多的橡胶烃链，然而IPP单体合成水平有限，分配到单位橡胶烃分子上的单体数量减少而导致天然橡胶平均分子量降低。本研究获得了的多个EuFPS5过表达株系表现出较高的产胶能力，为培育高产橡胶树提供了种质资源。同时，项目研究结果为后续通过调节单体IPP与起始基团APP的合成水平以调控天然橡胶产量和分子量提供了理论依据。