抗污融合多肽理性设计及其高效合成菌株研究

New antifouling peptide materials are designed rationally based on the mussel adhesion unit 3,4-dihydroxyphenyl (Dopa), and the relevant microbial synthesis platform would be constructed to relieve the biofouling in this project. Firstly, the pentapeptide “Dopa-Lys-Dopa-Lys-Dopa” as “bonding” functional unit and zwitterionic peptides as “antifouling” functional units are used to prepare the fusion peptides with excellent antifouling property by regulating the “antifouling” units variables (size, spatial structure, density, etc.). Then, the synthetic biology technology-orthogonal genetic system will be employed to obtain an initial artificial strain for synthesizing the antifouling fusion peptides containing the Dopa residue in an “One-Pot” reaction by codon optimization combined with the construction an orthogonal pair aminoacyl-tRNA synthetase/tRNA of Escherichia coli specifically recognizing Dopa with genetic codon extension technology. Furthermore, efficient synthesis of the antifouling fusion peptides would be focused with the genome-scale metabolic model of the initial artificial strain. 13C-Metabolic flux analysis combined with Enforced Objective Function algorithms are used to simulate and predict the potential target genes. Combining with promoter engineering to redirect carbon flux distribution, a high antifouling fusion peptides-producing engineering strain would be achieved, and the corresponding fermentation technology would be established with fermentation optimization.

针对生物污损问题，本课题基于贻贝黏附单元3,4-二羟基苯丙氨酸（Dopa）,理性设计新型多肽类抗污材料及微生物合成平台。以“Dopa-Lys-Dopa-Lys-Dopa”作为“铆钉”功能单元，两性离子多肽作为“抗污”功能单元制备抗污融合多肽，调控抗污单元变量（大小、结构、密度等），获得抗污性能优异的融合多肽结构；运用合成生物学正交遗传系统思想和遗传密码子扩展技术构建大肠杆菌特异性识别Dopa的氨酰tRNA合成酶/tRNA正交对，密码子优化获得“One-Pot”合成含Dopa抗污融合多肽的初始人工菌株；进一步开展基因组尺度代谢网络模型指导下融合多肽的高效合成，利用13C-MFA结合Enforced Objective Function算法模拟预测靶标基因，结合启动子工程进行分子改造，构建高产抗污融合多肽的工程菌株，并展开发酵优化技术研究，最终获得高效的抗污融合多肽及配套的工程菌株和发酵技术。

生物污损，是细胞、蛋白质、微生物等生命物质在固体基底表面发生附着、积累、繁殖所导致的材料或器件性能退化，造成器材损耗的过程。在医药、航海、建筑、食品等领域具有重要危害。针对生物污损问题，本课题以贻贝粘附蛋白模块作为“铆钉”功能单元，两性离子多肽作为“抗污”功能单元，利用合成生物学策略，理性设计了多功能蛋白类抗污涂层及微生物合成平台；对功能蛋白中的非天然氨基酸3,4-二羟基苯丙氨酸（Dopa），通过体外酪氨酸酶羟基化和体内共表达酪氨酸酶翻译后修饰的方法研究了蛋白中Dopa的转化效率，Dopa转化率可达59%，菌株改良及发酵优化后，蛋白产量可达到150mg/L，纯度>95%；获得的功能蛋白涂层可简易固定于玻璃、金属、塑料等多种基底材料表面，形成超亲水界面；该涂层具有抗蛋白、细菌/细胞粘附（>90%）、防雾、自清洁和抗结冰延长等功能，并具有优良的生物相容性（涂层溶血率低于0.1%，细胞共培养存活率高于99%）；进一步设计并制备了贻贝仿生三嵌段功能蛋白，该蛋白涂层能有效的粘附内皮细胞，同时抑制平滑肌细胞的粘附，有望作为涂层材料促进人工血管内皮化。相关研究成果已经在ACS Applied Materials & Interfaces、Chemical Communications等期刊上发表SCI收录论文8篇，申请发明专利2项，培养硕士生4人。项目研究对新型生物相容性材料设计及多种基底材料表面“一步修饰”有重要的指导意义与应用价值。