UNC5B 与 UNC5C 在血管与淋巴管内皮细胞分化中的作用及机理研究

Angiogenesis and Lymphangiogenesis are regulated by certain relatively specific transcription factors and growth factors; and the neuron-axonal guidance molecular systems are also involved in the regulation. Our early studies revealed that receptor UNC5B and NRP2 play important roles in the development of the blood and lymphatic vascular systems, respectively. Our most recent work discovered UNC5C, another member of the UNC5-receptor family, was expressed in the vascular endothelial cells of developing chicken and zebrafish vascular endothelial, more inclined to venous endothelial cells than UNC5B to the arterial endothelia. Moreover, we confirmed preliminarily that lack of UNC5C obviously impaired normal formation of venous and lymphatic vessels. Therefore, we hypothesized that UNC5B and UNC5B probably function in certain complementary or coordinating ways in the endothelial differentiation or maintain their venous and lymphatic characteristics. This project will be implemented through gene knockdown/out and overexpression, in different endothelial cells and by in vivo zebrafish verification, clarify the effects of UNC5B and UNC5C on cell nature and behavior, as well as gene expression, of different endothelial cells (EC), and explore the function and mechanism of UNC5B and UNC5C in vascular and lymphatic endothelial cells differentiation and maintenance.

血管与淋巴管生成，除受一些相对特异性转录因子和生长因子的调控外，神经轴突生长导向分子系统也参与其调节。我们早期的研究揭示了神经导向分子受UNC5B 和NRP2在血管与淋巴管系统发育中的重要作用。我们新近又发现，UNC5 家族的另一成员 UNC5C 在发育鸡胚和斑马鱼的血管内皮中表达，相对UNC5B倾向表达于动脉内皮，UNC5C的表达更倾于静脉内皮细胞；并初步证实UNC5C的缺失明显损害静脉与淋巴管的正常生成。因此我们推测， UNC5受体家族这两个成员很可能在内皮细胞分化为静脉和淋巴管内皮细胞的方面存在一定的互补和协调作用。本项目将通过在不同内皮细胞实施基因敲降/除和过表达，并通过斑马鱼活体验证，研究UNC5B和UNC5C对不同内皮细胞的细胞特性和行为，以及基因表达的影响，阐明UNC5B和UNC5C在血管与淋巴管内皮细胞分化与维持中的功能和作用机理。

本项目的研究目标是在完成 UNC5C CRISPR-Cas9 基因敲斑马鱼淋巴管系统表型分析的基础上， 通过在不同内皮细胞实施基因敲减/除和过表达，并通过斑马鱼活体验证，研究 UNC5B 和UNC5C 对不同内皮细胞的细胞特性和行为，以及基因表达的影响，阐明 UNC5B 和UNC5C 在血管与淋巴管内皮细胞分化与维持中的功能和作用机理。通过RNAi技术在HUVEC和人脐静脉融合内皮细胞（Eahy926）中对UNC5C和UNC5B进行基因敲低（knockdown），以及CRISPR/CAS9基因编辑技术对斑马鱼UNC5C基因进行敲除（knockout），本项目首先在斑马鱼早期胚胎发育和HUVEC体外成管过程中验证UNC5C在调节血管新生中的作用。结果表明，UNC5C作为一个负调控因子调控斑马鱼胚胎血管发育和HUVEC的体外成管；在体外HUVEC成管的模型中Netrin-1可以减低UNC5C对血管新生和细胞迁移的抑制。然后通过RNA seq技术探究UNC5家族在血管及淋巴发育中的功能作用及其机制。我们发现除了Sox18、Prox1、VEGFR3和Coup-TFII等已知的主导基因外， TGFA、EGR1、EGR3、FGF13、IGFBP3、JUNB和PDGFD，尤其是TGFA和FGF13，可能协同参与了血管内皮细胞的发育分化过程。进一步的机制探究表明，血管内皮细胞中Unc5C与Intergin6之间的相互作用来调控血管新生及细胞迁移。UNC5C可以直接结合ITGA6，并促进FAK,ILK,SRC和下游分子ERK,AKT的磷酸化，同样作为血管调节最重要的受体之一VEGFR2的磷酸化也有上调。综上，本项目不仅首次阐明了UNC5C基因在调节血管新生中的作用，而且为全面揭示Netrin-1/UNC5调节血管新生作用机制提供了新的线索。