脑缺血损伤时线粒体动态变化的调控机制及干预线粒体动态变化的神经保护作用研究

Stroke is a leading cause of death and disability. Mitochondria play very important roles both in health and disease. Mitochondria are highly dynamic cell organelles which exhibit "fission and fusion" dynamics. Mitochondrial fragmentation was observed in some pathological models of cultured cells which was suggested to induce cell damage. However, their behavior in the in vivo ischemic model is totally unknown. Furthermore, the mechanisms underlying the "fission and fusion" dynamics regulation and their effects on neuronal viability remain poorly understood. Using two-photon microscope, we will real time record the changes of neuronal mitochondrial morphology, and their membrane potential, super oxygen radical production in the in vivo photothrombosis ischemia model. Then the effect of mitochondrial "fission and fusion" dynamics on their physiological function and neuronal viability will be determined. By combined analysis of second-generation sequencing and bioinformatics, we will screen the microRNAs, which regulate the mitochondrial morphological dynamics, as a target to manipulate mitochondria. Furthermore, by cerebral delivery of miRNA mimics and miRNA antagomirs of screened miRNA, we will determine the effects of the miRNA on neuronal damage in the middle cerebral artery occlusion model. Not only will our work solve a basic scientific problem, but also probably provide a new therapeutic strategy or target for stroke.

脑缺血是严重影响人类生命健康的疾病。线粒体是具有高度动态性的细胞器，呈现"分裂-融合"的动态变化；其在神经元损伤过程中的关键作用已被认识。在培养细胞的病理模型中检测到线粒体的片段化，并有证据显示其片段化引发细胞损伤。然而，神经元的线粒体在在体缺血条件下的行为尚无研究，对线粒体"分裂-融合"动态的调控机制及其影响神经元命运的机制则更缺乏认识。本研究拟利用给培养神经元以氧糖剥夺的离体缺血模型及在双光子显微镜下造成光化学血栓形成的在体局部微中风模型，系统观测线粒体形态动态变化，并多角度研究线粒体形态变化对其功能的影响；利用第二代深度测序技术结合生物信息学分析，筛选出调控Drp1、Fis1、Opa1等线粒体形态动态变化相关蛋白的miRNA；离体、在体敲减所筛选的miRNA，研究其对神经元线粒体形态变化及对神经元存活的影响，并在在体缺血模型下检测其保护作用。研究结果将为脑卒中等疾病的治疗提供新策略。

脑缺血是严重影响人类生命健康的疾病。在脑缺血过程中氧糖供应不足导致细胞内产能受阻、离子失衡，造成胞外谷氨酸的大量积累。高浓度谷氨酸过度激活细胞膜上谷氨酸受体，引发胞内钙超载，线粒体片段化，线粒体功能紊乱，最终导致神经元死亡，这一过程被称为兴奋性毒性，广泛存在于中风及其他神经系统疾病的损伤过程中。线粒体是具有高度动态性的细胞器，呈现“分裂-融合”的动态变化。microRNAs是一类进化上保守的非编码RNA，它可以与靶基因相互结合，通过降解mRNA或抑制蛋白翻译的方式来调控基因表达。在脑缺血过程中，已有部分研究报道表明microRNAs可以参与兴奋性毒性中神经元损伤的调节，然而microRNAs是否能通过调控线粒体的动态变化来挽救该模型下的神经元损伤，及其作用机制却并未阐明。.本研究中，结合激光共聚焦成像、二代测序和生物化学等方法，对氧糖剥夺缺血模型及谷氨酸兴奋性毒性模型中神经元存活、线粒体形态变化及microRNAs表达变化进行了探究。在多种病理损伤模型中，均检测到了线粒体片段化和细胞活力下降；进一步检测线粒体分裂融合相关蛋白，发现Mfn2在损伤中显著下调，同时Opa1的剪切变体比例发生变化。为了深入探究microRNA在其中的调控作用，对谷氨酸处理后的microRNA表达谱进行测序，通过差异表达分析获得显著变化的microRNA candidates。利用含有TuD-RNA的慢病毒对进行特异性封闭，结果表明，封闭miR-X或miR-Y可以显著挽救谷氨酸造成的线粒体片段化，其中前者效果更为明显。进一步的存活实验结果表明，封闭miR-X和miR-Z可以显著挽救神经元活力。microRNA调控的靶基因及具体机制仍需要进一步探索。.本研究对兴奋性毒性中线粒体片段化和microRNA的变化进行了初步探索。结果表明操纵microRNA的含量可以显著抑制线粒体片段化且能挽救神经元损伤。这对于兴奋性毒性中细胞的损伤修复有一定的意义，将为脑卒中等疾病的治疗提供新策略。