东乡野生稻异源胞质不育育性恢复基因qRf5.1的克隆与育种应用

Utilization of heterosis is one of the important approaches for increasing yield, improving quality and increasing stress resistance in crop. Three-line hybrid rice breeding and seed production are primary based on cytoplasmic male sterility (CMS) and fertility restorer (Rf). .One major QTL for fertility restoration of alloplasmic CMS, qRf5.1, was detected using two backcross inbred lines derived from the cross between Dongxiang wild rice and Xieqingzao B. A set of residual heterozygous lines carrying the target QTL heterozygous region were developed using backcrossing, selfing and marker assay, and the target QTL was narrowed down to 200 kb region. To study its biological functions, the segregating populations were conducted for fine mapping of the QTL qRf5.1, and marker assisted selection of the QTL qRf5.1 also would be developed. The candidate genes and their corresponding sequences will be conducted for isolation and cloning of the QTL qRf5.1. RNA-seq and yeast two-hybrid system to screening verifying and analyzing of upstream and downstream genes of qRf5.1. This research will preliminarily ascertain the genetic and molecular mechanism of the qRf5.1 gene in fertility restoration, and benefit our understanding of the genetic and molecular mechanism of the qRf5.1 gene, provide theoretical and materials basis of molecular breeding for rice heterosis.

杂种优势利用是提高作物产量、改善品质、增加抗逆性的重要途径之一。三系杂交水稻育种和生产应用的首要基础是细胞质雄性不育(CMS)及其育性恢复系统。.前期研究利用东乡野生稻和协青早B构建的2套回交重组自交系检测到1个共同控制印水型和东乡野生稻胞质不育系等异源胞质不育育性恢复主效QTL qRf5.1。通过回交自交及标记选择，获得含目标QTL剩余杂合体(RHL)，进一步缩小至200 kb范围内。为了研究其生物学功能，拟利用该QTL次级分离群体精细定位育性恢复基因qRf5.1，通过候选基因及测序分析进行克隆，并建立qRf5.1的标记辅助选择体系；结合RNA-seq和酵母双杂交分析，开展上下游基因验证和分析，初步探明qRf5.1基因在水稻育性恢复中的遗传机制及分子机理。本研究为阐明恢复基因qRf5.1的遗传机理、杂种优势利用及其分子育种打下良好的理论和材料基础。

自我国三系杂交稻配套成功以来，骨干恢复系的恢复基因来源单一已成为三系杂交稻发展的主要障碍。因此，发掘和利用新的恢复基因是提高杂种优势利用的有效手段，也可有效避免三系恢复系的恢复基因单一化。“东乡野生稻”是江西特有的野生资源。. 利用协青早 B/东乡野生稻BC4F5回交重组自交系群体，分别在第 1、3、5、6和 10 号等5 条染色体上共检测到7个QTL，其中Rf6和Rf8等2个QTL为新恢复位点，并验证了恢复基因qRf5.1。同时结合BSA法进行QTL分析，分别在第1、3、4、6、7、8、10和12号染色体上检测到17个候选置信区间。. 利用携带qRf5.1的株系CSSL12和中9A构建F2群体，开展不育和可育组的高通量转录组测序分析，在可育和不育比较组中共鉴定出2,731个差异表达基因，其中下调的差异表达基因1963个，上调768个。而BSA分析，发现在第1、3、4、5、7、8、9、10、11和12号染色体共定位到202个SNP和111个InDel候选基因，其中有15个为非同义突变和1个移码突变基因；而在第5染色体有LOC_Os05g12020、LOC_Os05g30250、LOC_Os05g31620和LOC_Os05g36080等7个育性恢复相关候选基因。综合转录组和BSA分析，确立了2个与qRf5.1相关的育性恢复基因LOC_Os05g31620和LOC_Os05g36080。. 在候选LOC_Os05g36080附近存在一个编码PPR蛋白的基因Os05g0455900。应用协青早B与CSSL12株系开展测序比对和表达分析发现，该基因在两材料间不存在核苷酸变异；但其在CSSL12株系中的表达水平显著高于协青早B。这暗示Os05g0455900来自野生稻的等位基因可能拥有更强的功能，可以恢复协青早A的育性。亚细胞定位和组织特异性表达分析结果显示，该基因所编码的蛋白主要定位于叶绿体内，其在茎和幼穗中的表达较高。. 开发恢复基因qRf5.1的连锁标记RF01及其分子标记辅助选择技术体系，创制携带qRf5.1的苗头恢复系青恢798等一系列恢复种质。. 这些研究结果为揭示水稻恢复基因的起源、育性恢复性状的进化及遗传机制奠定基础；也对发掘和利用野生稻中新的恢复基因源、丰富杂交水稻恢复基因的遗传多样性、促进水稻杂种优势的利用具有重要实践意义。