解淀粉芽孢杆菌小基因组菌株基因组的进一步优化以及聚谷氨酸的合成

The chassis cells possess many favorable features such as low substrate consumption, high propagation speed and vigorous metabolism. However, not the smaller genome strains exhibit the better features. The construction of chassis cell (including basic substance and energy metabolic genes and genes involved in cell construction, propagation and regulation) possesses important theoretical significance. The main content of this study is the further optimization of the chassis cell of Bacillus amyloliquefaciens strain. This project including the following aspects: ① construction of the chassis cell of the B. amyloliquefaciens based on our previously constructed genome reduced strain (with 9.85% of its redundant genes deleted) by monitoring the cell growth, metabolic characteristics and parallel gene deletion experiments on wild-type strain; ② the optimization and improvement of the chassis cell genome such as introducing heterologous vgb gene, relocation the oriC etc.; ③ exploring the functions of dnaN, oriC (ori2, dnaA and ori1) and the replication initiation factor YabA； ④ construction of the final excellent chassis cell with multiple copies of oriC and dnaN; ⑤ construction of the γ-PGA producing strain based on the excellent chassis cell and study its growth characteristics and γ-PGA synthesis.

基盘细胞具有底物消耗量低、繁殖速度快和代谢旺盛的特点。但并非基因组越小效果越好。构建基盘细胞 (包含基础物质、能量代谢基因、细胞结构、繁殖代谢基因和重要调控基因) 具有理论研究意义；解淀粉芽孢杆菌基盘细胞基因组的进一步优化是本研究的重要内容。本课题研究内容包括：①利用前期已构建好的敲除了9.85%冗余基因的小基因组菌株，通过监测生长与代谢特征和无痕基因敲除并行实验的方法，确立解淀粉芽孢杆菌LL3的最适基因组，构建底盘细胞；②对基盘细胞基因组进行进一步优化和改良，包括引入外源基因vgb、调整oriC位置等；③ 研究oriC (ori2、dnaA、ori1)和dnaN以及复制起始调控因子YabA在基因组复制中的功能；④构建出oriC和dnaN多拷贝菌株，最终获得优良基盘细胞；⑤在优良基盘细胞的基础上构建γ聚谷氨酸合成菌株，研究其生长特征和γ-聚谷氨酸合成。

基盘细胞是构建“细胞工厂”的关键步骤。优良的细菌基盘细胞可显著改善“细胞工厂”性能、提高目标产物的合成效率，在工业生物技术应用方面具有重要意义。本研究从减小基因组规模、加快菌体生长速度、基因线路改造、调控群体行为等方面对细菌基盘细胞构建、优化及其调控进行探究。.（1）减小基因组规模并筛选基盘细胞。将B. amyloliquefaciens LL3 的6个基因组岛及4种次级代谢产物合成酶基因簇成功敲除，对精简度为2%、4%、4.7%、6%、7.5%的菌株，进行生理功能的检测。与NK-1相比，GR167生长加快，转化效率提高109%；GR303还原力提高33%，蛋白表达提高69.3%。.（2）加快菌体的生长速度。本研究对复制起始的关键蛋白DnaA、DnaN和YabA分别过表达，通过诱导剂的浓度调控相应蛋白的转录。结果表明DnaA、DnaN转录提高，可以加快菌体的生长速度。将该结果应用于GR167的优化，DnaA和DnaN在GR167中过表达，获得GR167AN，其比生长速率与GR167相比提高24%。.（3）优化基因线路，提高产物合成。在GR167基础上，对surfactin结构类似物iturinA和丰原素合成酶基因簇进行敲除，得到GR167ID，将可能的转运蛋白YcxA、YbfB及脂肽合成关键酶SFP进行过表达，获得GRYYS菌株。该菌surfactin产量较GR167ID提高了54%。从启动子库中选用Psuc、Ptpxi强启动子更换srf基因簇原始启动子后， surfactin的产量分别为GR167ID的9.4倍，2.5倍。.（4）对基盘细胞的群体行为进行调控。将构建的AI-2消耗者菌株与基盘细胞GR167进行共培养，对其产物合成进行调控。结果表明，NK-C4:GR167IDS接种菌体比例为1:1、1:5和1:10时，surfactin产量分别增加32%、109%和300%。.(5) 代谢改造解淀粉芽孢杆菌提高γ-聚谷氨酸产量。γ-PGA前体物质谷氨酸是细菌碳氮代谢转换的重要中间体，对其下游代谢通路进行阻断或抑制来提高胞内谷氨酸含量，并且强化了谷氨酸前体α-酮戊二酸的供应。最终得到NK-A11的γ-PGA产量最高达到7.53 g/L，与LL3相比提高2.05倍。.(6) 代谢改造解淀粉芽孢杆菌合成伊枯草菌素。.本研究为今后细胞工厂构建的途径提供了参考。