绿僵菌素诱导斜纹夜蛾SL-1细胞凋亡的信号转导机制

细胞凋亡是细胞的主动性死亡过程。本项目拟以斜纹夜蛾SL-1细胞为供试材料，利用荧光倒置相差显微镜和流式细胞仪从线粒体反应、细胞内外Ca2+平衡、胞内重要酶活力变化三方面对绿僵菌素诱导SL-1细胞凋亡的作用靶标进行研究，揭示绿僵菌素诱导SL-1细胞凋亡的作用机制。借助MPTP开放抑制剂CsA对绿僵菌素诱导SL-1细胞凋亡中线粒体信号转导通路进行研究，阐明线粒体通路在SL-1细胞凋亡中的作用，明确绿僵菌素诱导SL-1细胞凋亡中的信号转导机制。应用胞外Ca2+抑制剂EDTA和胞内Ca2+螯合剂BAPTP/AM研究绿僵菌素诱导SL-1细胞凋亡中Ca2+所起的作用及其对线粒体通路的影响，阐明Ca2+失衡导致细胞凋亡的机理。本研究不仅为阐明绿僵菌素诱导SL-1细胞凋亡信号转导途径提供理论依据，而且为新型杀虫剂的筛选开辟新的途径，对于今后创制具有自主知识产权的新型生物农药具有重要的指导意义。

细胞凋亡是细胞的主动性死亡过程。本项目拟以斜纹夜蛾SL-1细胞为供试材料，主要研究：（1）绿僵菌素A 和B对SL-1 细胞均具有明显增殖抑制作用，并随时间和浓度的增加呈较好的时间-效应和浓度-效应关系，绿僵菌素A 和B处理细胞48 h 后的IC50 值分别为17.86 μg /mL和7.80 μg /mL。IPCM观察发现，绿僵菌素A和B可以引起SL-1细胞变圆、胞膜收缩、有凋亡小颗粒形成。FM观察发现，绿僵菌素A 诱导的细胞荧光强度高于绿僵菌素B。FCM检测结果表明，10 μg/mL绿僵菌素A和B作用细胞48h后，SL-1细胞的总凋亡率分别为78.88%和72.23%。（2）绿僵菌素A作用SL-1细胞的蛋白差异表达分析。选取17.86 μ g/mL 的绿僵菌素A 作用SL-1 细胞24 h 的总蛋白进行蛋白比较分析。应用2-DE 技术分别分离对照组和绿僵菌素A 处理组SL-1 细胞的总蛋白。结果显示，对照组和绿僵菌素A 处理组的总蛋白质点数分别为 624和635，与对照组的平均匹配率为93.2%。（3）绿僵菌素A、B对斜纹夜蛾SL-1细胞氧化损伤的作用。80.0 μg/mL绿僵菌素A和B处理48 h，其还原型GSH的相对含量分别降低了77.99 %和68.22 %。（4）绿僵菌素对SL-1细胞膜通透性的影响。绿僵菌素A和B处理SL-1细胞48 h后，细胞膜表面变光滑且微绒毛消失，细胞出现塌陷，穿孔，花样褶皱或皱缩，瘤状突起，甚至破裂死亡，并有大量小泡附着在细胞周围。（5）绿僵菌素A、B对SL-1细胞信号转导的影响。绿僵菌素A和B处理后的SL-1细胞，在低浓度处理（2.5 μg/mL和5.0 μg/mL）后细胞内Ca2+离子浓度始终高于对照，但高浓度处理（10.0 μg/mL以上）后细胞内Ca2+离子浓度变化出现先降低后升高的变化趋势。（6）绿僵菌素对细胞线粒通透性转换孔道（MPTP）的影响。绿僵菌素处理SL-1细胞后，细胞线粒体MPTP开放程度经历先降低后升高再降低的过程。本研究不仅为阐明绿僵菌素诱导SL-1细胞凋亡信号转导途径提供理论依据，而且为新型杀虫剂的筛选开辟新的途径，对于今后创制新型生物农药具有重要的指导意义。