牦牛体内胚胎、体外受精胚胎和核移植胚胎附植前细胞调亡的特征及其机理

The abnormal apoptosis of preimplantational embryos would cause the failure of embryo development in earlier stage. Apoptosis was seen in normal developmental and artificial constructed preimplantational embryos,respective. At present, the research about relationship between the apoptosis and embryo development ability is at the starting stage. The materials about apoptosis and its molecule mechanism of in vitro fertilization and artificial constructed preimplantational embryos were seldom found. In this study, morphological, immunohistochemistic and RT-PCR techniques was used to inspect apoptosis, apoptosis related proteins and genes expression of various preimplantation stages of bovine embryos produced both in vivo and in vitro; In vitro embryo cultural system was also used to analyze the effect of some cytokines to apoptosis and apoptosis related proteins expression. This study would provide important information to our understanding of apoptosis mechanisms in preimplantation embryo development and could be valuable for fundamental studies in early embryogenesis and assisted reproduction techniques to more effectively protect the genetic resources of yak in our country.

附植前胚胎细胞异常凋亡是发育早期胚胎夭折的重要原因。在正常发育早期和人工构建的胚胎中都发现了不同程度的细胞凋亡现象。目前有关凋亡与植入前胚胎发育关系的研究尚在起步阶段，尤其是对哺乳动物体外受精及人工构建胚胎早期发育阶段的细胞凋亡及其分子机理的研究鲜有报道。本项目采用形态学、免疫组织化学和RT-PCR技术，检测正常发育早期、体外受精和核移植胚胎在附植前各个发育阶段的细胞凋亡现象、凋亡相关蛋白及基因的表达；并在体外培养体系中观察相关细胞因子对胚胎细胞凋亡及相关蛋白表达的影响。旨在阐明牦牛附植前胚胎细胞凋亡的变化规律、信号传导通路及其在不同来源胚胎之间的差异；从细胞凋亡的角度探讨早期胚胎夭折的机理和人工操作对早期胚胎发育潜能的影响，为进一步提高牦牛繁殖效率和辅助繁殖技术水平提供理论依据。

牦牛作为青藏高原地区重要物种资源，通过辅助繁殖技术提高其繁殖性能对我国“丝绸之路经济带”畜牧业的发展至关重要。为了提高体外生产牦牛胚胎的质量，阐明牦牛胚胎附植前细胞调亡机制，并试图通过生长因子改善牦牛卵母细胞和胚胎冷冻技术及体外发育能力。本项目运用Real-time PCR、WB、TUNEL标记、免疫荧光方法等方法检测牦牛卵母细胞及体外不同来源胚胎发育过程中Bax、Bcl-2、TP53、HSP70、Fas、Fasl等细胞凋亡蛋白的表达，通过EGF、IGF及TGF等家族生长因子作用，改善牦牛卵母细胞的体外成熟率和胚胎发育能力，提高精子和卵母细胞冷冻技术，并检测生长因子作用下细胞凋亡及组蛋白修饰相关基因的表达水平，同时分析其对生殖细胞的作用。主要研究成果为：（1）FSH和FBS抑制牦牛卵丘细胞凋亡发生至少部分由Fas-Fasl凋亡系统来介导，最终提高卵母细胞的发育能力。（2）牦牛胚胎存在细胞凋亡现象，最早在三细胞阶段胚胎中观测到，桑椹胚和囊胚发生细胞凋亡的比例要明显较高，牦牛囊胚中存在典型的凋亡超微特征。（3）生长因子EGF、IGF-1在牦牛卵母细胞成熟和胚胎发育过程中作为重要的自分泌或旁分泌因子，可通过调控Bax、Baxi、Bcl-2、HSP70和Survivin等凋亡相关基因的表达提高牦牛卵母细胞和体外受精胚胎的发育能力。（4）生长因子BMP6可以提高牦牛卵母细胞和SCNT胚胎的发育潜能，其作用类似于其他OSFs，且这种调节作用与其调控组蛋白修饰和细胞凋亡有关。（5）CT和SSV玻璃化冷冻方法对牦牛未成熟卵母细胞具有相同的冷冻效果，且其对发育能力的影响主要集中在成熟期到早期卵裂期，并与HSP90的表达水平有一定关联性，而卵母细胞成熟过程中IGF-1可以调控CIRP的表达，提高成熟卵母细胞对低温的适应能力，降低低温对卵母细胞损伤，从而提高后续发育能力。研究成果为通过相关生理学调控提高牦牛胚胎体外发育提供了新的科学突破点，改善了牦牛辅助繁殖技术，有助于牦牛种质资源的保护和改良等相关技术的改进。