基于自噬探讨正气的现代医学内涵以及补肾活血温经中药复方防治糖尿病周围神经病变的分子机制

The pathogenesis of diabetic peripheral neuropathy (DPN) does not fully clarified and effective therapies for DPN are still lacking. The material basis of healthy qi are still without understanding. Autophagy that maintain homeostasis is similar as the content of healthy qi which can eliminate the pathogen and repair body. This research will construct pDS-RED-Cl-Beclin1 RSC96 cells and pgenesil-Atg6-siRNA RSC96 cells to detect the expression and mRNA of LC3-Ⅱ, Beclin1, p-Akt, p-mTOR, p70S6K, 4EBP1 for chceking the effects of glucose on autophagy in RSC96. Then we evluate the mitochondrial fission (Fis1 and Drp1) , fussion (Mfn1, Mfn2, Opa1) and apoptosis(mitochondrial membrane potential, cytochrome C, caspase-9, caspase-3, Bcl-2 and Bax) are affected by high concentration glucose via autophagy. Furthormore we find the material basis of healthy qi by studying the effect of tonifying the kidney and promoting blood circulation and warming the meridian on autophagy. There are nether related research about whether functions of autophagy is damaged by high glucose in the nerve tissue, which would not effectively remove the impaired mitochondria nor about the modern medical connotation of healthy qi.It is very important to reveal the pathogenesis of DPN and find the potential method of preventing and treating DPN and provides a new method of the study of traditional Chinese medicine basic theory by integrative medicine and lay the foundation for clarifying the mechanism of action of the theory of traditional Chinese medicine and traditional Chinese medicine for the treatment of DPN. The new models of abnormal expression of autophagy in SC are also useful for the future research.

糖尿病周围神经病变（DPN）发病机制未阐明，缺乏治疗手段。中医正气的物质基础仍无统一认识。自噬维持机体稳态的生理特点与正气抗邪、修复等内涵有相似之处。本研究通过转染、siRNA技术建立自噬过表达及基因沉默的雪旺细胞（SC）模型，探讨不同浓度葡萄糖对SC自噬（Beclin1等）和高糖时自噬变化对线粒体融合（Mfn1等）、分裂（Drp1等）、线粒体途径凋亡（膜电位、CYC、Caspase-3等）的影响，并通过补肾活血温经中药对自噬的干预作用以寻找人体正气的物质基础。国内外尚无高糖是否会造成周围神经组织细胞自噬功能受损，以致不能有效清除受损线粒体的相关报道及有关正气现代医学内涵的研究。本课题对于揭示DPN发病的新机制和寻求DPN防治新方法具有重要意义，也为中西医结合研究中医传统理论提供了新的思路，有助于阐明中医理论和传统中药治疗DPN的作用机理。SC自噬异常表达模型也为今后研究提供了参考。

糖尿病周围神经病变发病机制未阐明，缺乏治疗手段。本研究通过转染、siRNA技术建立自噬过表达及基因沉默的大鼠雪旺细胞（RSC96）模型，探讨不同浓度葡萄糖对其自噬和高糖时自噬变化对线粒体融合、分裂、线粒体途径凋亡的影响及中药“筋脉通”君药菟丝子的有效成分槲皮素对上述途径的作用机制。结果发现高糖可下调Beclin1基因转录及蛋白表达，同时下调LC3，上调Akt、mTOR、p70S6K及4EBP表达；可使正常RSC96细胞增殖活性减低，线粒体融合相关蛋白表达减少，分解相关蛋白表达增多，促使CYC转移到细胞质中，线粒体凋亡途径相关蛋白表达增多。当自噬Atg6基因被抑制后，高糖条件下细胞增殖活性则进一步降低；正常及高糖条件下，线粒体融合减少，分解增多，促使CYC由线粒体转移到细胞质中，线粒体凋亡途径相关蛋白表达增多。自噬过度活化时，在正常及高糖环境下，均将造成细胞增殖活性的降低，线粒体融合减少，分解增多，促使CYC由线粒体转移到细胞质中，同时会造成细胞线粒体凋亡途径的激活。槲皮素可增加高糖时LC3蛋白表达水平，下调Akt、mTOR、p70SK及4EBP表达，增加细胞增殖活性，线粒体融合增加，分解减少。当自噬Atg6基因被抑制后，加入槲皮素后细胞增殖活性无明显恢复，不能纠正线粒体融合分解异常，线粒体凋亡增加；自噬过度表达后，槲皮素也不能改善细胞增殖活性，不能增加线粒体融合，但可减少线粒体分解，线粒体凋亡增加。本研究构建自噬Atg6过表达及沉默模型，可为今后药物筛选提供建模参考。同时研究认为高糖下调自噬，增加线粒体损伤，促进线粒体途径凋亡，抑制细胞增殖活性。抑制自噬或自噬过度活化均将进一步增加线粒体损伤，加剧线粒体途径凋亡，加重抑制细胞增殖活性。槲皮素增加高糖时细胞自噬，起到保护作用，该作用与自噬途径可能有关，但其不能阻止过度自噬导致细胞凋亡。生理性自噬减少可能在导致高糖损伤的重要机制之一，自噬本身又具有双重作用，不足与过度均将造成损伤的加重，精准调控自噬可能成为糖尿病周围神经病变的防治的新靶点。