从AGEs－骨胶原交联和AGEs/RAGE/MAPK信号机制探讨二仙汤防治糖尿病性骨质疏松症机理

Diabetic osteoporosis (DP) causes an increase in fracture risk, which is associated with advanced glycation end products (AGEs) accumulation in bone collagen, and inhibition of osteoblast maturation.. Our previous study found Er'xian decotion (EXD) increased bone mass in osteoporotic mice , and promoted osteoblast maturation. The molecular target was related to type II diabetes mellitus (DM) and MAPK signaling pathway. Based on the previous data, we plan to build DP model and cell culture to observe the effect of DM on bone mass and bone strength, especially:EXD action on crosslink of AGEs and collagen: including crosslink quantity, isomerization of ColI as well as catobolic changes of ColI. The effect of EXD on bMSCs and osteoblasts activities. We would further examined the role of AGEs/RAGE/MAPK/ signaling pathway in DP pathogenesis and EXD action. The aim of the project is to further clarify DP pathogenesis and provid experimental data for DP treatment by traditional Chinese medicine(T.C.M.).

糖尿病性骨质疏松症（DP）多发生脆性骨折，其病理机制是糖基化终化产物（AGEs）在骨胶原中堆积，阻碍成骨细胞成熟。.本项目组前期研究发现补肾方药二仙汤能够增加DP小鼠骨量，促进成骨细胞成熟，其分子靶点提示与Ⅱ型DM和MAPK信号通路密切相关。在前期基础上，本项目通过建立DP模型及细胞培养，观察DM对骨量和骨强度的影响，并重点观察二仙汤对AGEs与骨胶原的交联作用（包括交联含量、ColI异构化程度和分解代谢变化）以及对DM状态下骨髓间充质干细胞（bMSCs）和成骨细胞功能影响，深入研究二仙汤对AGEs干预下bMSCs和成骨细胞AGEs/RAGE/MAPK信号转导机理，以进一步阐释DP的病理机制，为中医药治疗DP提供实验依据。

本项目时在前期研究工作的基础上，进一步确定二仙汤及中药有效组分治疗糖尿病(DP)骨质疏松的疗效及与AGEs相关作用机制，为补肾方药治疗该病提供实验依据。.研究内容包括（1）二仙汤对DP 骨质疏松的疗效评价；（2）二仙汤对DP 骨质疏松AGEs 和ColI 交联的作用；（3）AGEs对BMSCs中RAGE及其下游NF-kB的作用；（4）厚朴酚，柚皮素，苦参碱，金丝桃苷，姜黄素对DP 骨质疏松的疗效评价。.研究结果（1）C57小鼠建模失败，改用DBA\2J小鼠。高糖高脂饲料喂养，禁食12h，腹腔注射链脲佐菌素40mg/kg，腹腔注射后2小时再投料，连续5天，诱发DM 模型。1 周后尾静脉采血检测空腹血糖，不达标小鼠再次追加一次STZ。每两周测一次血糖。结果显示，模型组造模成功（造模一月后血糖>10mmol/L)，但二仙汤对血糖并没有显著的改善作用。micro-CT显示，模型组骨体积比BV/TV和骨小梁厚度Tb.Th较正常组明显减少，二仙汤可以显著提高这两个参数，改善骨量。(2)我们已经对这些小鼠股骨样本进行了胶原和成熟胶原交联含量检测，I型胶原异构化程度含量检测。对小鼠血液进行了ColI分解代谢检测和AGE相关产物吡啶诺啉（PYD），脱氧吡啶诺啉（DPD）和戊糖苷（PEN）的ELISA检测。结果显示：模型组股骨骨胶原含量显著减少，二仙汤组可以显著增加骨胶原含量。血液中ColI分解产物I型原胶原交联氨基端端肽，I型原胶原交联羧基端端肽，I型原胶原氨基末端肽，I型原胶原羧基末端肽均在造模后升高，二仙汤可显著降低这些ColI分解产物。模型组血清AGEs 包括吡啶诺啉，脱氧吡啶诺啉，戊糖苷素含量均显著升高，二仙汤组显著降低血清中上述三种AGEs含量。免疫组化结果显示：骨髓细胞AGEs受体RAGE阳性率在正常组和模型组的之间没有显著差异，但二仙汤组RAGE减少。(3) 以10，50和100ug/mL AGE干预原代小鼠骨髓间充质干细胞，50-48h和100可以显著增加RAGE含量，50-48h增加NF-KB含量最显著。(4)设立二甲双胍组作为阳性对照。治疗一个月后，厚朴酚降血糖疗效最优。增加骨小梁厚度有效率从高到低排列分别是：柚皮素，苦参碱，厚朴酚，金丝桃苷和二甲双胍。.二仙汤可作为糖尿病骨质疏松治疗方案，但降血糖效果不佳；厚朴酚在降血糖和增加骨量两方面均有作用。