发掘水稻转运和同化尿素的功能基因以探索氮肥高效利用的新途径

申请人曾克隆和鉴定出高等植物中第-个主动运输尿素分子的基因（AtDUR3），同时，较详细地阐明了模式植物拟南芥经AtDUR3和水通道蛋白吸收尿素的分子机理与植物氮素营养状况的生理关系。尿素是粮食作物稳产高产的主要氮素化肥来源，但是，其有效利用率很低，同时造成严重的环境污染。虽然作物能够直接吸收、转运和利用尿素作为氮源而生长，但是其转运和同化尿素的生理学和分子生物学机理尚未被科学界所认识。就世界范围而言，水稻是重要的粮食作物，需要投入大量的尿素氮肥。鉴于解决这一问题的重要性和迫切性，本课题拟通过对水稻吸收、同化尿素的生理学机制、分子生物学遗传基础的深入研究，系统地阐明模式作物-水稻直接吸收、利用尿素的分子生物学机理，并利用所创造的转基因水稻品种，验证其具有高效利用尿素氮肥的科学推论。从农业生产实践的角度推知，该课题的研究成果将为提高作物的（尿素）氮肥利用率提供新的理论依据和技术策略。

水稻的高产依赖于大量氮肥如尿素的施用，但尿素氮的利用效率不到40%。虽然作物高效利用尿素在农业和生态平衡中具有重要意义，但植物转运尿素的分子生理学机制以往仅限于在拟南芥中进行。因此，本项目以水稻为模式，在分子生理学水平上详细地探索了其吸收利用尿素的生物学机理。课题完成的主要成果如下：.1）通过对水稻利用氮素的生长表型及相关的生理学鉴定，发现水稻对尿素的吸收不足是其生长不能有效利用尿素的重要生理限制因子；较精确地鉴定了水稻吸收尿素的生理动力学特征，即水稻中至少存在高（Km ~ 8μM）和低亲和力的尿素转运系统。2）通过同源基因搜索，发现水稻中仅存在与拟南芥尿素转运蛋白AtDUR3的同源基因，此命名为OsDUR3。生物信息学分析表明OsDUR3含721氨基酸残基，具15个跨膜域，为典型的膜转运蛋白。利用酵母及爪蟾卵母细胞异源系统表达OsDUR3以及C14-尿素吸收技术，鉴定出了OsDUR3能促使尿素的跨质膜转运以及其所介导的尿素吸收具有典型的米氏酶动力学特征（其Km值为~9 μM）。3）运用GFP标记、原生质体转化及显微检测技术，发现OsDUR3蛋白在细胞质膜中定位表达，由此推知水稻经OsDUR3途径吸收外界尿素的生物学可能性。4）基因表达调控研究表明 OsDUR3在根中的转录受植物缺氮及尿素的诱导；组织水平上，发现OsDUR3在衰老器官如老叶中的表达量较高；种子萌发芽时，OsDUR3表达量随的时间推移而升高，由此推知OsDUR3不仅与植物的氮营养状况相关和参与水稻吸收外源尿素，而且在植物氮素再循环利用中也可能发挥重要生理学作用。5）OsDUR3在拟南芥atdur3突变体及野生型中的超表达能明显改善植物利用外界较低浓度尿素的生长状况，能显著增强植株对尿素的吸收能力。6）发现OsDUR3的突变导致水稻利用尿素为氮源时的生长受到抑制以及对尿素的吸收量明显低于野生型植株，表明OsDUR3对水稻有效吸收和利用外源低浓度尿素态氮具有重要的生理学意义。7）生理水平上，对水稻OsDUR3基因突变是否影响植物生长及利用氮素的状况进行了鉴定；创建了OsDUR3超表达的水稻转基因植株。8）构建了“适于利用酵母菌分离水稻功能基因的水稻根部全长cDNA文库”，并通过酵母基因功能互补试验筛选到三个其他可能性的尿素转运蛋白基因。总之，上述研究成果为培育氮高效的作物新品种提供了重要的理论和技术依据。