RGM-Neogenin在异位骨化中调控成骨分化的分子机制

异位骨化（HO）是骨骼系统外软组织发生的软骨内骨化，会引起关节活动受限功能障碍，机制至今不明。目前防治手段均通过抑制成骨，除存在相应的副反应和高失败率外，对原位成骨如骨折愈合也存在影响，难以在不干扰原位成骨的同时控制HO。目前已知，排斥导向分子RGM，及其在骨骼肌高表达的受体Neogenin，与调控成骨分化的BMP/smads信号通路紧密相关，具有选择性防御骨骼肌骨化的研发潜能。而其抑制成肌细胞等HO前体细胞成骨分化的分子机制，以及对在体HO组织形成的影响均不清楚。因此，本课题拟通过RGM-Neogenin干预体外培养HO组织的前体细胞，分析RGM-Neogenin负向调控细胞成骨分化的作用，以及调控可能存在的干扰因素，以揭示骨骼肌防卫骨化的调控机制，并通过动物模型检验这一防卫机制的作用效应。从而找出针对性防治骨骼肌骨化的优化方案，为HO防治的基础和临床研究开辟新思路。

本课题中首先参考颅脑损伤和骨骼肌损伤以往报道模型，通过动物实验最终未采用原课题计划的颅脑损伤合并四头肌损伤模式，而改用新型颅脑损伤合并小腿三头肌跟腱损伤的动物模型。实验证实复合损伤组（颅脑损伤合并小腿三头肌跟腱损伤）较单纯损伤组有较高的异位骨化的发生率（53.8%）。体外成肌细胞和骨髓间充质干细胞(rBMSC)BMP-2诱导成骨分化实验中，经典BMP2受体并无上调，而L6的Neogenin的mRNA是下调的，并且，使用Neogenin下游的Rho/ROCK拮抗剂Lyso PA可以促进L6 的成骨分化。进而我们采用siRNA（通过4片断筛选效果最佳者）和RGM多肽片断干扰Neogenin-Rho/ROCK通路发现，抑制neogenin通路后L6的ALP及成骨特征基因表达明显上调。高于对照，甚至BMP2诱导水平。提示Neogenin及Rho/ROCK通路激活或抑制影响着L6的成骨分化。同时，RGM蛋白水平并无明显变化。在体实验中，Neogenin受体在肌肉组织的表达强度虽然较BMPR弱，但免疫荧光检测可以清晰反映其沿肌膜分布，并通过各组组织学分析和相关组织的分子生物学分析，进一步证实不同组的Neogenin 、RGM、BMPR及成骨特征基因表达的差异和之间的关联。采集各组的0天、14天和6周标本，虽然Neogenin mRNA的水平在2周的标本有一定的下调，但其蛋白水平并无显著性下调，两组间在14天的标本有显著性差异，但6周时的异位骨化阳性的标本二者的OCN和Runx2表达无显著差异。取样时动物模型血清的炎症介质水平的变化TNF，IL-6 和IL-10无显著差异。