重组类人胶原-骨形成蛋白融合材料的制备及其诱导成骨作用的研究

Bone morphogenetic proteins (BMPs) can induce ectopic bone formation, and is considered as an optimized candidate to treat bone defects when delivered via a collagen sponge. However, the application and exploitation of animal collagen is restricted due to its potential for immunogenicity and virus contamination. Furthermore, collagen sponge rapidly releases BMP with a high burst phase that is followed by a low sustained phase. Recombinant human-like collagens (HLCs) are similar in structure to human collagen, and have good biocompatibility such as low immunogenicity and little risk from hidden virus. In the proposed study, we will construct a HLC and human bone morphogenetic protein-2 (hBMP-2) complex through recombinant expression of fusion proteins in Escherichia coli. The release rate and the activity of the fusion protein will then be tested via protein concentration test, cell proliferation, cell differentiation and bone defect repair assays. As a novel delivery system for hBMP2, the HLC-hBMP2 fusion protein developed in this study will be valuable for bone defect repair and bone regeneration research.

将骨形成蛋白（bone morphogenetic protein, BMPs）与动物胶原蛋白复合，获得具有诱骨活性的骨缺损修复材料是目前植骨材料研究领域的热点。但动物胶原蛋白一方面有引起免疫反应和传播病原体的风险，另一方面因BMPs与胶原蛋白主要以物理吸附作用结合，导致BMPs的缓释效果不理想。本课题在已有类人胶原蛋白（human-like collagen, HLC）研究的基础上，首先利用基因工程技术重组HLC和人骨形成蛋白-2（human BMP-2, hBMP2），构建其原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达具有柔性接头的HLC-hBMP2融合蛋白；进一步揭示融合蛋白释放速率对细胞增殖分化及动物体内诱导成骨的影响，阐明HLC-hBMP2释放速率与其诱骨作用的关系，为构建可充分利用hBMP2的植骨材料提供新的设计思路和理论依据。

通过胶原海绵（CS）递送骨诱导剂（如骨形态发生蛋白（BMPs））是治疗严重骨创伤的一种可选方案。然而已有研究表明，治疗过程中难以精确控制CS载体中BMP的浓度变化和释放速率。在此项目中我们利用基因工程技术重组HLC和hBMP2融合蛋白，构建出了pPIC9K- HLC-hBMP2真核表达载体，在毕赤酵母菌（Pichia pastoris GS115）中诱导表达了具有柔性接头GGGGS的HLC-hBMP2融合蛋白。该融合蛋白保留了HLC的特性，且能够在筛选出的酵母菌株中高效表达，易于纯化，已实现大规模生产。同时，此方法也保持了HLC和hBMP2在体液环境中的稳定特性，生物相容性好，无细胞毒性。此外，重组融合蛋白可以被交联制备出具有垂直通孔结构，具有较高机械性能，从而有利于大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）迁移到融合材料中。此外，该融合蛋白在体内降解和释放hBMP-2，使骨诱导活性和利用率提高，能精确控制hBMP2的释放。研究发现HLC-hBMP2融合蛋白在应用于大鼠颅骨缺损时，具有骨诱导活性，并提高了骨修复能力，与单独使用HLC和未植入材料的对照组相比，修复率分别提高了3.5倍和4.2倍。我们的数据表明这种新型重组融合蛋白在骨缺损的治疗中比单纯使用胶原海绵物吸附hBMP2更加安全有效，研究结果为构建可充分利用hBMP2的植骨材料提供新的设计思路和理论依据。