芒果果肉类胡萝卜素合成的转录调控机制研究

Carotenoids are pigments accumulated in ripe mango flesh, and visual attractiveness and nutritional value of mango flesh can be improved through increasing the carotenoid accumulation. Expression of gene encoding enzymes for the main steps of carotenoid metabolism are correlated with carotenoid accumulation, as revealed by previous studies. However, transcription factors directly mediating carotenoid biosynthesis were rarely isolated in higher plants, and molecular regulation of carotenogenic gene expression and carotenoid formation in plants remains a challenge. Our previous studies found that the expression of PSY, BCH and ZEP are strictly associated with carotenoid formation in mango flesh. In this project, we will (1) isolate promoter sequence of PSY, BCH and ZEP, and identify the cis-elements by promoter deletion method; (2) screen candidate transcription factors by yeast one-hybrid and transcriptome sequencing technologies; (3) examine its regulation characteristics using dual-luciferase system system; and (4) analysis function of key transcription factors by over-expression analysis in tomato and mango callus. These results will help to understand transcriptional regulation underlying carotenoid biosynthesis in higher plants, and the isolated transcription factor genes will be very useful molecular tools for improving mango fruit quality.

类胡萝卜素是芒果果肉呈色色素，其含量影响果肉的视觉吸引力和营养价值。目前，类胡萝卜素合成途径结构基因已基本阐明，其转录水平影响类胡萝卜素的积累。然而果树果实中直接控制类胡萝卜素合成的转录因子尚未被分离，结构基因的表达如何被调控，进而影响类胡萝卜素成分和含量的机制，尚不清晰。我们前期研究发现，芒果果肉中类胡萝卜素含量与PSY、BCH和ZEP基因的转录水平显著相关，为进一步探明芒果类胡萝卜素合成的调控机制，本项目拟克隆上述基因的启动子序列，采用缺失和突变方法筛选和鉴定与结构基因表达密切相关的核心调控区段；利用酵母单杂交和转录组测序等方法筛选与之结合的候选转录因子；通过双荧光素酶体系研究其对结构基因的调控方式，并采用番茄和芒果愈伤组织转基因体系验证候选转录因子的功能。项目研究能够为高等植物胡萝卜素合成的转录调控机制提供理论支持，还可为改善芒果果实品质实践提供重要基因资源。

本研究以芒果MiPSY1、MiBCH和MiZEP基因为切入点，克隆和鉴定了这3个基因的启动子序列和表达活性；进一步通过酵母单杂交系统、基因共表达网络分析等方法，筛选可能与MiPSY1、MiBCH和MiZEP启动子互作的转录因子。从‘Irwin’果肉中克隆获得了MiPSY1、MiBCH和MiZEP启动子序列，其长度分别为1236bp、1328bp和1192bp；生物信息学分析表明，各启动子序列中含有典型的TATA-box和CAAT-box基本顺式作用元件；稳定遗传转化烟草试验表明，所克隆的启动子活性受光照和激素的影响。以不同发育期果肉混合样品为材料，构建了酵母单杂交cDNA文库。 cDNA文库总克隆数大于106，平均插入片段大于1kb，文库的质量符合后续酵母单杂交的要求。以MiZEP基因启动子序列为诱饵，利用酵母单杂系统，筛选芒果果肉cDNA文库，获得了一些与MiZEP启动子互作的调控因子。本研究选择bZIP家族类转录因子MibZIP60做进一步研究，基因表达结果显示MibZIP60与MiZEP在果实发育过程中的表达呈正相关关系，且与β-胡萝卜素积累量正相关；双荧光素酶报告实验证明MibZIP66可以激活MiZEP启动子活性。基于RNA-seq数据开展了基因共表达网络分析（WGCNA），初步获得了一些调控MiPSY1表达的候选转录因子。本研究选择7个候选转录因子近一步研究，双荧光素酶试验表明MibZIP60和MibHLH45能显著激活MiPSY1启动子活性。通过酵母单杂及点突变实验证实MibZIP60和MibHLH45能特异结合MiPSY1启动子中CACGTG序列。