内质网胁迫相关转录因子HUG5的生物学功能、调控机理以及与植物抗逆性的关系

环境胁迫是世界范围内粮食减产的主要原因之一，深入探明植物耐逆的遗传与分子生物学基础，提高作物的耐逆性，是关系我国国家粮食安全和可持续发展的迫切需求。当植物细胞内质网内蛋白的折叠受到逆境等的干扰时，未折叠蛋白和错误折叠蛋白大量积累，从而导致内质网胁迫。在拟南芥中通过化学试剂衣霉素诱导内质网胁迫，发现转录因子HUG5基因的表达急剧上调。在此基础上，通过分子生物学和遗传学等技术研究HUG5在干旱、盐害、高温和氧化胁迫等环境胁迫应答中的生物功能，采用生物化学和细胞生物学等方法研究HUG5调控下游基因的分子机理，分离HUG5启动子中环境胁迫应答顺式作用元件，筛选并验证与之相互作用的反式作用因子。这些研究从不同角度解析HUG5在环境胁迫引起的内质网胁迫应答中的功能与调控，对系统认识植物对环境胁迫应答的分子机理，以及有效利用相关基因增强作物耐逆性等有着十分重要的理论意义与应用价值。

蛋白质折叠是真核细胞中的基本生物学过程，蛋白质折叠过程极易受到外界环境胁迫的干扰。当大量错误折叠或未折叠蛋白聚集在内质网中后，可引起内质网胁迫，启动未折叠蛋白应答（UPR），帮助蛋白折叠或将不能正确折叠的蛋白质降解。在模式植物拟南芥中，目前研究比较清楚的内质网UPR调控通路主要有S2P-bZIP28和IRE1-bZIP60通路，但拟南芥内质网UPR过程中基因调节机制研究仍然不够清楚。我们发现NAC103是典型的NAC家族蛋白，N端具有非常保守的DNA结合域，C末端具有转录激活活性，能够形成同源二聚体，NAC103-YFP融合蛋白定位于细胞核内。在拟南芥中稳定表达NAC103-YFP后，转基因植物在正常生长条件下表现为发育迟缓、开花推迟，UPR下游基因（比如CRT1、CNX1、PDI5、UBC32）上调表达。原生质体瞬时转化实验表明：CRT1、CNX1等下游基因1000bp上游启动子序列能响应内质网胁迫诱导剂的诱导，正常条件下共表达NAC103蛋白能够激活CRT1、CNX1等启动子驱动的报告基因。在加入内质网胁迫诱导剂的培养基上，与野生型拟南芥相比，过量表达NAC103-YFP的转基因植物出真叶率较高，而低量表达NAC103的转基因植物出真叶率较低。这些结果表明NAC103能调控UPR下游基因的表达，在内质网胁迫应答中发挥了重要的作用。利用拟南芥原生质体瞬时转化法和双荧光素酶报告基因检测方法分析了NAC103启动子序列中的顺式作用元件。通过不断截短和碱基突变分析，发现NAC103启动子序列包含一个新的UPR顺式作用元件UPRE-III。结合原生质体瞬时转化、酵母单杂、凝胶迁移实验等多种方法证明bZIP60能够直接结合UPRE-III。在内质网胁迫应答中依赖于bZIP60表达的53个下游基因中，19个基因的转录起始位点前1000bp启动子序列中含有至少一个UPRE-III顺式作用元件，暗示UPRE-III可能也是调控其它UPR基因上调表达的顺式作用元件。已有的报道证明内质网胁迫应答与植物应答各种生物和非生物逆境有密切联系。通过本项目资助，我们发现了一个新的内质网胁迫应答顺式作用元件UPRE-III，阐明了一个植物特有的转录因子NAC103在内质网胁迫应答中的生物功能，建立了一个围绕NAC103的植物内质网胁迫应答的转录调控单元，加深了我们对植物内质网胁迫应答的理解。