灰树花(Grifola frondosa)糖肽复合物结构片段与抗肿瘤活性关系的研究

食用菌多糖及糖肽（蛋白）复合物是国内外活跃的研究领域之一，其活性与结构密切相关。在前期研究中我们已获得灰树花(Grifola frondosa)新型活性糖肽GFPS1b，初步分析了其结构和体内外抗肿瘤活性。为进一步明确食用真菌多糖复合物构效关系，阐明其体外抗肿瘤作用的分子机制，本项目拟采用酶法或化学法剖离糖肽样品中糖链和蛋白(肽)链，高效亲合层析技术纯化制备糖链和蛋白（肽）等结构片段；GC-MS、2D-NMR、MALDI-TOF-MS、X-Ray等方法确定糖链片段中单糖残基之间连接次序、糖苷键构型、主链及支链构成等情况，蛋白组组学方法获得蛋白（肽）链氨基酸序列；结合其体外抗肿瘤的水平和作用方式，确定糖肽的抗肿瘤活性结构组分及其对应构效关系，并从细胞和分子水平阐释糖肽样品及其活性结构组分体外干扰敏感肿瘤细胞增殖的内在分子机制和途径，以期为其他来源多糖复合物构效关系的研究供一定理论指导依据。

多糖及糖肽(蛋白)复合物是食药用真菌中主要的功能营养成分，具有抗肿瘤、抗真菌/病毒作用和免疫调节等活性。基于前期研究工作，本项目首次以灰树花深层发酵菌丝体为原料和体外抑制肿瘤细胞（人胃癌细胞SGC-7901和小鼠肉瘤细胞S-180）增殖为指标，分离纯化得到具有显著抗肿瘤作用的糖蛋白组分GFG-3a，其相对分子质量为88.01kD，多糖和蛋白含量分别为6.20%和87.04%。GFG-3a含有O-糖肽键和α-糖苷键、-CO-NH-基团，其糖链结构可能存在（1→3）-Glu、3-O-methyl-Galactose、（1→3）-β-Galacose等基团。GFG-3a是一种β-折叠占主导地位的糖蛋白，N端序列为ATRVNHVPSV，并通过胶上酶解结合MALDI-TOF-MS解析了其他部分的氨基酸序列；NCBI检索证实，GFG-3a的蛋白结构未曾有报道，因此基于其氨基酸序列构建了蛋白链可能的3D模型。GFG-3a具有一定的热不稳定性，经PNGase F酶解后的蛋白链组分的抗肿瘤活性明显高于糖链组分的抗肿瘤活性，表明其具有抗肿瘤作用的结构片段为蛋白链。形态学分析发现，高剂量GFG-3a能够导致SGC-7901出现小泡、凋亡小体和DNA损伤，阻滞SGC-7901细胞在S期。差异蛋白质组分析发现，经GFG-3a处理后，SGC-7901细胞内11个蛋白下调，10个蛋白上调，其中RBBP4、RUVBL1、NPM、 HNRNPH2、HSP90AB1、GRP78、ACTL6A 和ARCN1涉及细胞周期、调亡和内质网压力响应等。差异转录组结果表明，经GFG-3a处理后，共有155个基因显著上调（上调倍数≥2.0），66个基因显著下调（下调倍数≥2.0）。其中，IL24、CDKN1A、IGFBP1、TUBA1A等上调基因和HIGD1B，VWCE和PPEF2等下调基因值得关注。综合荧光定量PCR、DNA-PAGE电泳和Western blot等实验结果，GFG-3a可能是通过Casp 8和Casp 3依赖性细胞调亡通路、p53-调控的线粒体调亡通路、PI3K/AkT信号通路实现其体外杀伤胃癌细胞SGC-7901的作用。本项目的研究结果全面揭示了灰树花多糖复合物的结构和抗肿瘤作用的分子机制，同时也为其他来源的多糖复合物的研究提供一定的参考。